牛病毒性腹泻病(BVDV)E2糖蛋白表达的复制子颗粒疫苗的开发和评估.docVIP

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2糖蛋白表达的复制子颗粒疫苗的开发和评估 课题来源：Loy J D, Gander J, Mogler M, et al. Development and evaluation of a replicon particle vaccine expressing the E2 glycoprotein of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in cattle[J]. Virology journal, 2013, 10(1): 35. 摘要 背景：牛病毒性腹泻病毒全世界广泛存在、对畜牧业危害严重的牛病毒性病原体之一。甲病毒衍生的复制子颗粒已被证明是对人和动物具有安全和高度有效的疫苗载体。复制子颗粒不具有传播性，可以同时诱导体液和细胞介导的免疫反应。本研究是第一个实验来证明，基于甲病毒的复制子颗粒在一个标准的加强免疫接种方案可以免疫病原体，具有很大的商业意义。 结果： 牛病毒性腹泻病毒的子基因1b型的E2糖蛋白表达的复制子颗粒产生并表达被证实，可在体外使用多克隆抗体和单克隆抗体表达E2。颗粒制成的疫苗，在Vero细胞中生成，BVDV加强免疫方案接种牛犊的两个剂量水平。疫苗接种导致交叉中和1型和2型BVD基因型加强免疫后中和抗体滴度。此外，高剂量的疫苗接种证明一些对临床疾病的保护，并显着降低由病毒感染引起的白细胞减少症的程度。 结论：BVDV E2糖蛋白表达的颗粒疫苗，用强免疫方案可诱发交叉中和抗体滴度，减少白细胞减少后的难题，减轻临床上疾病的牛犊。本研究保证BVDV E2糖蛋白表达的颗粒疫苗为一种安全和有效的BVDV疫苗。 关键词：BVD，牛病毒性腹泻病毒，病毒复制，复制子颗粒疫苗 1 调查结果 1.1 背景资料 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种有包膜的，正链RNA病毒中的瘟病毒属（黄病毒科），的病原体。 BVD是在世界上经济上危害严重的牛的疾病之一。估算生产的亏损大约10-40万美元的美国每百万产犊[1]。经典的牛病毒性腹泻病毒已伴有急性肠道疾病，牛病毒性腹泻病毒现在被认为具有各种各样的临床上疾病，包括牛呼吸系统疾病、生殖损失、和胎儿感染[2]。牛病毒性腹泻病毒的E2基因编码的53 kDa的主要的结构糖蛋白，它包含一个中和表位不同的菌株[3]。单克隆抗体特定E2具有中和病毒能力，针对细胞病变和非细胞致株牛病毒性腹泻病毒（越南）[4]。目前对BVDV的策略：以减少由受感染的畜群的BVD而造成损失为主，主要包括接种改良的活疫苗或灭活疫苗（MLV）和消除持续性感染的动物。如今没有市售的重组或载体疫苗，因此，只能使用活MLV或灭活疫苗的方法[5]。此外，一些成功的实验已经证明使用BVD 类病毒粒子缺失一个在结构基因，使用同源辅助性的RNA的反式可以预防BVDV。 基于复制子表达系统从族披膜病毒科的甲病毒（委内瑞拉马脑炎（VEE）病毒）[7,8]衍生，基于甲病毒复制粒子为疫苗发展具有许多优势，包括原生的、准确的生产蛋白质和传播缺陷的性质，使得该系统只能够一个单一的感染周期[9]。以前曾用于表达该病毒载体的众多的病原体包括人类基因流感病毒株，猴免疫缺陷病毒，诺沃克病毒，埃博拉病毒，天花病毒，拉沙病毒，马动脉炎病毒[10-16]，有一个强大的RP安全性。已经证明，RP是不传染疫苗接种动物，并因此不能传播未接种疫苗的动物。此外，RP一直具有病毒复制能力，BVD 类病毒粒子存在下进行测试通过重组生产过程，可能出现的RP和已被证明是没有能力恢复毒力[17]。甲病毒RP也已测试针对牛口蹄疫病毒（FMDV）（库尔特Kamrud，个人通信），但没有测试市场上的病牛。因此，建议病毒RP的表达牛病毒性腹泻病毒E2糖蛋白将提供一个BVD新颖、安全、有效的方法来控制。 2.方法 E2糖蛋白基因合成（DNA2.0）牛病毒性腹泻病毒亚型1B菌株NY1（基因：AY027671）序列。 E2基因被克隆到一个复制子载体的质粒（如前所述的[8]）和测序证实，以确保在克隆过程中没有突变引入。通过的线性化的复制子的质粒DNA按如前所述[8]，用T7 RNA聚合酶体外转录产生RNA。电穿孔细胞转染，以使表达载体能导入真核细胞，RP产生E2复制子RNA和结构基因辅助的RNA颗粒[16]导入Vero细胞（Vero细胞是单分子层），然后在MOI为10感染与E2 RP存在下的E2表达的E2 RP使用高效免疫多克隆猪血清（数据未示出）的感染的细胞裂解物的Western blot分析证实。此外，使用E2特异性单克隆抗体（图1）的间接免疫荧光法证实了E2蛋白的表达。 实验，牛犊8周龄，来自BVD免费的牛群。每只动物进行测试，并且进行牛病毒性