11第十一讲蛋白质的分离与纯化(二)精读.pptVIP

第十一讲 蛋白质的分离与纯化（二） 一、问答题（每题5分共30分）： 蛋白质工程的基本途径或主要步骤 什么是构型、构型，二者的主要差别。 Anfinsen原理及其意义。 紫外可见吸收光谱和荧光光谱。 什么是核磁共振（NMR）？实现核磁共振的两种方法是什么？ 什么是化学位移？1970年IUPAC规定，衡量化学位移的相对标准是什么？规定其化学位移常数是多少？表示化学位移物理量的符号和单位的符号各是什么？ 二、简述题（每题10分共40分） 蛋白质一级结构、二级结构、超二级结构、结构域和三级结构及其主要作用力？它们之间的相互关系怎样？ 如何理解蛋白质工程的含义（狭义和广义理解），其主线是什么？ 什么是基因突变技术，包括哪两大类技术？举例说明这两大类技术包括哪些方法。 预测蛋白质三级结构的方法有哪些？描述一种你熟悉的蛋白质高级结构预测方法的操作流程。 三、方案设计（10分） 某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，但对热稳定性较差，进入人体后容易失效，现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗消化不良，通过蛋白质工程手段能否提高蛋白质的稳定性，请您试设计两套改造方案，简述改造方案依据的原理。 提示和要求：一套方案采用分子生物学修饰，另一套采用化学修饰。 四、论述题（20分）： 论述蛋白质一级结构测定的基本程序以及主要方法和原理。 第四节 精制分离—液相色谱技术 概述 常见色谱技术介绍 2、 液相色谱法的发展 1850年，德国化学家Runge将古罗马时期分析染料与色素的方法进行改进，发展成为纸色谱。 1903年，俄国植物学家 Tsweet 在华沙生物学会议上发表分离植物色素的论文， 1906年，Tsweet首次提出“色谱法” 和“ 色谱图”的概念。 “色谱法”（Chromotography） “ 色谱图” （Chromatogram） 1941年，英国生物化学家Martin与英国化学家Synge （获诺贝尔奖）创立液液分配色谱，以水份饱和硅胶为固定相，含乙醇的氯仿为流动相分离乙酰氨基酸。 1970年中期，微处理机技术用于液相色谱，提高了液相色谱的自动化水平和分析精度。 80年代，色谱联用技术发展迅速，逐渐出现了色谱—光谱联用、色谱—质谱联用、二维色谱（色谱—色谱）等技术。 1990年以后，生物工程和生命科学的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，促进了高效液相色谱技术的发展。 2、液相色谱的发展 在色谱技术中，液相色谱（Liquid chromatography）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢。 液相色谱普及之前，纸色谱、气相色谱和薄层色谱是色谱分析的主流。 20th60S’，将较为成熟的气相色谱 理论与技术应用于液相色谱，使液相色谱迅速发展。 特别是填料（色谱柱）制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。 1969年，液相色谱仪商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱被称为高效液相色谱法（HPLC） 更加 微量、快速、高效、广泛。 新进展：微柱—HPLC、无孔色谱短柱—HPLC、毛细管—HPLC 3、液相色谱的类型 吸附层析 adsorption chromatography 分子筛层析 molecular sieve chromatography 离子交换层析 ion exchange chromatography 亲和层析 affinity chromatography 分配色谱—液-液色谱 疏水色谱—疏水作用 等电点聚焦色谱—pI 高效液相色谱—高度自动化的液相色谱 1、吸附分离色谱？ （1）概念： 利用固相吸附剂对不同物质的吸附力不同，进行物质分离的液相色谱技术。 （2）原理： 通过范德华力，流动相中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进入流动相（洗脱剂）。 不同物质在固相和液相之间分配系数或解离平衡不同。 通过连续的吸附—解吸附—再吸附过程将物质分离。 （3）影响因素？吸附剂、溶剂、被分离物质的性质“三方面” 吸附剂：凡能对其它物质具有吸附作用的固体物质。 吸附剂选择原则： 根据：吸附剂性质、溶剂的性质、被分离对象的性质——选择。 表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。 如何理解——选择原则？（三者之间相互影响关系）： 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。 为了便于解吸附，对于极性大的分离物，选择极性较小的吸附剂，反之亦然 。 极性吸附剂、分离弱极性物质、弱极性溶剂洗脱；分离强极性物质、用强极性溶剂 理想吸附剂和溶剂的选择：依据原则，依靠经验和多次试验。 常用吸附剂： 硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、羟基磷灰石等 硅胶的硅醇基