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糖化酶的生产，分离纯化的过程 生工（2）班 座机电话号码210 朱玲玲 黑曲霉是我国生产糖化酶制剂的主要菌种。为了更好地开发利用我国的糖化酶资源, 我们对黑曲霉搪化酶进行了分离提资源, 我们对黑曲霉搪化酶进行了分离提纯, 得到了电泳均一的搪化酶, 并对其性质进行了研究。糖化酶（EC3.2.1.3）是应用于淀粉工业中最重要的一种酶, 能从淀粉的非还原末端依次水解α-1 , 4糖昔键而释放葡萄糖。糖化酶（gluca mylase ） 又名糖化型淀粉酶（glueoamylase）或淀粉葡萄糖苷酶。其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。糖化酶是一种胞外外切酶，但其专一性低，主要是从淀粉链的非还原性末端切开α-1.4-键。一般淀粉水解程度达80％在日本市售的糖化酶制剂多由黑曲霉而来。有关糖化酶的纯化及特性鉴定, 文献中已有报道。主要用途是作淀粉糖化剂。在食品工业制造葡萄糖、麦芽糖、糊精糖浆和直链淀粉薄膜，改善面色质地，加工蔬菜、制造菜汁、菜泥。在发酵工业方面与α-淀粉一起还广泛用在谷氨酸、柠檬酸发酵生产中，作为淀粉原料，代替了麦芽和液体，提高了淀粉利用率。在我国，糖化酶还用于处理原理，水解棉中的低聚糖，减少棉纤维的粘缠以利于纺纱。但由于材料及纯化方法不同, 结果亦不尽相同。文献中从黑曲霉粗酶液中分离糖化酶, 第一步多采用硫酸按分级, 而后透析除盐再进一步纯化。这样步骤繁多而费时。本文拟以黑曲霉糖化酶粗酶液为材料, 探索糖化酶简便而高效的分离提纯条件, 且利用多种方法对其性质进行了研究。 （一）材料 菌种：黑曲霉CICIM GB0506 Aspergillus CICIM GB0506 , 携多拷贝糖化酶基因, 为本实验室前期构建的基因工程菌,实验室保存，备用。 保存培养基：麸皮：水 1：1， 1Kg／cm2 灭菌20分钟 查氏斜面培养基：0.3％NaNO3,0.1％K2HPO4,0.05％KCl,0.05％MgSO4·7H2O,0.001％ FeSO4·7H2O,3％蔗糖，1.5％琼脂粉，自然pH,用于黑曲霉的菌种保存和活化培养。[1] 液体培养基为:0.5％KH2PO4,2％聚胨6％碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖或木糖），1％黄豆粉饼，自然pH。 活化培养基Ⅰ : 采用TZ 培养基, 每升含有3g 牛肉膏、15g 蛋白胨、2g 酵母抽提物、2g NaCl、15g 淀粉、20g 琼脂, pH 5.8。 活化培养基Ⅱ : 在CD 培养基中分别加入1% 玉米淀粉 CD1 或 0. 2%酵母粉 CD2 或两者的混合物 CD3 。 种子固体培养基: 采用查氏固体 CD 培养基。 种子液体培养基: 每升含有3g 牛肉膏、15g 蛋白胨、2g 酵母抽提物、2g NaCl、15g 淀粉、1g 琼脂, pH 4. 5。 摇瓶发酵培养基: 每升含有30g 玉米浆、30g 硝酸铵、100g葡萄糖, pH 5.5。在发酵培养基中接入8% 种子液,34℃、220r／min摇床发酵120~ 144h,三角瓶装液量为50mL／250mL。 （二）糖化酶的生产 1.活化培养方法[2] 将- 70℃ 冰箱的黑曲霉重组菌甘油管保藏物适当稀释后, 涂布活化培养基及种子固体培养基各3 块, 34℃ 培养72~120h。以菌落大小及发酵摇瓶酶活值为指标, 检测活化效果。菌落大小为每块平板随机选取30 个菌落的菌落直径平均值,单位: mm。 2.种子液制备方法 以涂布活化培养基上挑出单菌落划线于种子固体培养基, 34℃培养72~ 120h; 从种子固体平板上挖4cm2 左右的琼脂块放入种子液体培养基, 34℃ 以不同打散方式培养96~144h。 3.打散方法 采用CD3 为活化培养基, 分别采用不同规格玻璃珠, 铁丝对菌丝体进行打散。以菌体浓度及发酵摇瓶酶活值为指标, 检测打散效果。菌体浓度值由种子液经稀释,分别涂布3 块CD3 平板计算得到的平均值, 单位: 105个／mL。 4.酶活测定方法[3] （1）钢圈法： 5ml 3% 琼脂倒皿 →再加5ml可溶性淀粉与3% 琼脂→放入三个灭过菌的钢圈 分可溶性淀粉与3% 琼脂→放入三个灭过菌的钢圈 分别滴入不同浓度的酶液→定期测定透明圈直径。 （2）比色法： 10ml 20% 可溶性淀粉 5ml 柠檬酸 PH4.8 （对照不加酶液，处理加1ml） 加1ml10%NaOH 终止反应，对照补加1ml 酶液→滤纸过渡→比色。 5.酶的纯化 将工厂生产的酶发酵液离心 4000r/min ,20 min 后, 将上清液置于布氏漏斗过滤, 滤液再离心 15000r/min ，15min 上清液作为粗酶液。 取粗酶液50 m l , 加固体硫酸钱到50 %饱和度, 置冰箱过夜。然后于4℃ 离心 15 0