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组织培养过程示例 组织培养步骤 1、培养基配制 母液 品名 MS配方 （mg/L） 100倍母液用量 （mg/L） 大 量 元 素 母液1 硝酸铵 1650 165000 母液2 硝酸钾 1900 190000 母液3 硫酸镁 370 37000 母液4 二水氯化钙 400 40000 母液5 磷酸二氢钾 170 17000 铁 盐 母液6 EDTA二钠 37.3 3730 硫酸亚铁 27.8 2780 微 量 元 素 母液7 碘化钾 0.83 83 硼酸 6.2 620 一水硫酸锰 16.9 1690 硫酸锌 8.6 860 钼酸钠 0.25 25 硫酸铜 0.025 2.5 称50mg配成100ml,配培养基时取5ml 氯化钴 0.025 2.5 称50mg配成100ml,配培养基时取5ml 有 机 物 母液8 肌醇 100 10000 烟酸 0.5 50 VB6 0.5 50 VB1 0.1 10 甘氨酸 2 200 按照上表配成100倍母液8种，各配成1L，各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中 MS培养基中还需要加入萘乙酸（NAA）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）等植物生长调节物质，并且分别配成母液（1 mg/mL）。其配制方法是：分别称取这2种物质各100mg， NAA用少量乙醇溶解，6-BA用少量的NaOH溶液，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得1mg/mL的母液。 1当量氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，加蒸馏水定容到100mL。 1当量盐酸：量取浓盐酸9mL，加蒸馏水定容到100mL。 以配制1L培养基为例： 用量筒或移液管从各种母液中分别取出10ml, 与各种母液一起放入烧杯中。然后量取所需浓度的NAA或6-BA加入烧杯中，称取蔗糖30g,加入烧杯后，定溶到1L。 调pH值? 用酸度计或PH试纸测溶液PH值（可用1当量的氢氧化钠和1当量的盐酸调节PH值直到培养基的pH为5.8为止），培养基的pH必须严格控制在5.8。 称取5g左右琼脂粉倒入烧杯中，然后在电炉上加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。 培养基的分装? 溶化的培养基应该趁热分装。将烧杯中的培养基倒入培养瓶中，注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。每1L培养基，可分装25～30瓶。 培养基分装完毕后，用硫酸纸或封口膜及时封盖瓶口。如果组培瓶有盖则盖上盖子。 培养基参考： 增殖培养基：MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 5g/L 生根培养基：MS+ NAA0.2+蔗糖30g/L+琼脂粉 5g/L 培养基配方是在不断实践摸索中，才能找到最适合的培养基。 2、培养基灭菌 将分装好的培养基放入高压蒸气灭菌锅灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。 到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5MPa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了 灭好菌后，让培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用 3、接种 植物材料表面用消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接种到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体（explant 。 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。 洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性