tricine注意事项和要点.doc

对于小分子量的蛋白可以考虑一下Tricine-SDS，即用三羟甲基甘氨酸（tricine）代替甘氨酸作为终止离子Tricine-SDS可以有效地分离1-100 kDa的蛋白样品 下面推荐两个Tricine-SDS电泳的protocol，供参考。 推荐I 首先是Nature Protocol上的一篇专门介绍Tricine-SDS的文章，作者是该领域的专家——Schǎgger。 Nature Protocols 1, - 16 - 22 (2006) Published online: 12 May 2006 | Corrected online: 10 August 2006 | doi:10.1038/nprot.2006.4 Tricine-SDS要与小蛋白打很多交道的同志们可以仔细研读一下这篇文章，总结整理出适合你的具体方案。 推荐II 只是想看看Tricine胶的分离效果，偶尔一试，可以参考下面这个具体的protocol。 Tricine胶的配方 阴极、阳极缓冲液的配方 介绍：常规的Tris-SDS电泳的只能分辨大分子物质的，而对了相对分子量小的，尤其是10kD以下的蛋白分辨率极低。本人用Tris-SDS做一个20KD以下的蛋白结果不是很理想，而且重现性差，因为在这种不连续的缓冲系统中，低分子量的常常堆积在浓缩胶中。而Tricine-SDS可以很好的分离30KD以下的蛋白，而且本人还发现它同样对大蛋白也适用，我用它做过45KD，90KD，120KD左右的蛋白，而且每次上样3uL的Marker跑出来的10条带清清楚楚，几乎是平行的跑下来，常规的Tris-SDS加了10uL的效果也没它好，有时越大下面越不清楚，也越窄。如果，有战友做小蛋白的话不妨试试看，下面是实验配方和步骤。一、缓冲液的配置：1.正极缓冲液anode buffer（X）：0.M Tris(pH 8.9):12.114g加H20定容至500ml, 4保存。2.负极缓冲液 cathode buffer (1X):0.1M Tris +0.1M Tricine+0.1%SDS 不用调pH：6.057gTris+8.96gTricine+0.5g SDS 加H20定容至500ml, 4保存。3. 凝胶缓冲液 gel buffer(G-B, 3X):36.342gTris+0.3gSDS加H20定容至100ml H20,HCL调pH=8.45,过滤4保存。4. AB-3 储存液(49.5%T,3%Cmixture):24g丙烯酰胺+0.75g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml,过滤4保存。 5．AB-6储存液(49.5%T,6%Cmixture):23.25g丙烯酰胺+1.5g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml,过滤4保存。二、具体的步骤：1.按如下配方制备分离胶和积层胶：4 % 积层胶(3ml) 10%分离胶(8ml)AB-3(mL) 0.25 -- AB-6(mL) -- 1.6 3×gel buffer(mL) 0.75 2.67 甘油(mL) -- 0.63 H20(mL) 2 3.1 10% APS(uL) 22.5 40 TEMED(uL) 2.25 4 先注入分离胶，待分离胶凝固后（0.5-1小时），注入积层胶。待积层胶凝固后（0.5-1小时）。2. 上样电泳:总蛋白取25uL,细胞组分蛋白根据BCA定量后取75ug,加入6×SDS上样缓冲液煮沸5 分钟，12000rpm离心2分钟，取上清进行蛋白电泳。准备电泳时，在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液，用30V的电压预电泳10分钟，然后上样。当染料从积层胶进入分离胶后，电压加到90V,继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。整个电泳过程在冰上或4进行。3． 转膜和抗体孵育1）??电泳近结束时，将裁好的与凝胶尺寸相当的PVDF膜先用甲醇浸透活化后，用去离子水漂洗，然后浸泡在转移缓冲液中。另外，裁剪六张尺寸一致的滤纸连同海绵垫一起置于转移缓冲液中浸泡。2）??电泳结束后，小心取出凝胶，浸泡于转移缓冲液中，在转移缓冲液中安装转移装置，从负极到正极按如下顺序装置：海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫。注意清除各层之间