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引物设计实例分析 引物设计基本原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 阅读框 2.产物的长度 扩增片段长度为100~600碱基对. 3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G) 5.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 第二步：利用Primer Premier 5设计引物 Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能 。 打开程序首先进入的是序列编辑参看 Automatic Search 自动搜索 Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列。可以使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列,并从剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法。进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活，用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式，也可以手工键入引物序列。一旦引物被编辑发点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物。 引物长度 引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度.对越多数实验适宜引物长度为18到24个碱基,等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建library protocol ,28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用。长PCR引物能给扩增带来更好的特异性,长引物也允许通过降低退火温度来能提高反应的灵敏度,不过长引物通常更易于形成包括发卡结构二聚体自身互补等二级结构。 理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡。 为设计一条高效引物有几个参数必须考虑PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次如下 Tm 融链温度：PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论nearest neighbor theory 来计算融链温度。PCR反应的合适Tm范围为56到63°C。 GC% GC含量：对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。 Degeneracy 多义性：当设计多义引物时应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免3末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。 3’ End Stability 3 末端稳定性：引物稳定性影响它的错配效率。一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端，如果引物3 稳定性强有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩secondary bands。 而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。 GC Clamp GC钳：引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端，这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。 Secondary Structures 二级结构 二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量。发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率。形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。 Hairpin 发卡结构 发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成,引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对.发卡结构的稳定性可以用自由能衡量,自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量,如果自由能值大于0 则该结构不稳定,从而不会干扰反应.如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。按下按钮All 可以显示其具体结构。 Dimer 二聚体 引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结