引物设计学习总结-董近曲-20140_...资料.ppt

引物设计学习总结 医学检测技术部 董进曲 2014.03.03 引物介绍 引物 引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等; 上游引物：DNA分子两端不一样，因为核苷酸分子不是对称的，5位有个磷酸，3位是-OH 就是：磷酸端和羟基端。DNA复制总是从5’端到3’端，因为DNA聚合酶只能往3’端加核苷酸。所以谁先复制谁上游，往后的就是下游，上游下游是个相对概念，是某一个序列／碱基相对于另一个序列／碱基而言。 DNA是双链，两个链是反向平行的，DNA聚合酶顺着其中一个链走，这个链就是负链，另一个链是反着一段一段复制的，这个是正链.所以上游引物就是位于整个扩增子（就是被扩增的目的序列）的5’端的引物。同DNA负链互补，同正链序列相同,下游引物反之。 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 引物的设计原则 一般性原则 长度：15—30bp，其有效长度[Ln＝2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性； G十c含量：应在45％一55％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)； 碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发; 引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构; 引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠; 特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。 引物的3’端、ΔG、TM 引物的3’端很人程度上影响Taq酶的延伸效应,引物的3’端碱基最好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T.避开引物的二级结构区：某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响； 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 引物的设计方法 人工设计 直接根据引物设计原则手动编写引物； 此方法适合于拥有丰富引物设计经验，对引物设计原则及注意事项掌握熟练的人； 缺点：耗时，只适用于熟练掌握设计原则的人。 软件设计 通过设计好的软件直接设计引物； 软件是基于引物设计原则编写的； 其设计功能主要体现在引物分析评价和自动搜索功能上； 部分人认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价。 优点：快速，自动化。缺点：设计好后还需辅以人工分析。 网页设计 通过特定网页直接得到设计好的引物； 优点：对全基因组 PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。 引物设计的软件 Oligo 6.22 Oligo 6.22其初始界面主要分为三个图（：Tm 图和 ΔG 图和Frq 图），其分别代表了引物TM值、G值和邻近6~7个碱基组成的亚结构在数据库文件中出现的频率; 其中TM值曲线选取72℃为最佳；G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的 G 值在 5’端和中间值比较高，而在 3’端相对低； 引物设计出以后，我们首先要确认其二二聚体形成的能值的多少，其次是发夹结构能值的大小，二者最好都在4.5以下，最后我们需要检查GC含量的百分比，最好是在45%~55%之间； 在引物设计并检查完毕后，我们还可以在弹出的PCR窗口中，总结性的看见引物的位置、产物的大小、TM值等参数，还给出了最佳退火温度和简单的评价； Oligo 6.22对引物的分析能力相对Primer Prem