[参考】基于冷冻电子显微镜学的生物大分子的高时空分辨率的结构和功能研究.Doc

一、研究内容 本项目将进行以下几个方面的研究: 课题一，高通量、全自动化的冷冻电镜数据采集和三维重构图像处理方法的研究 开发高通量、全自动化的电镜数据采集和处理方法, 以及高性能的三维重构算法 在冷冻电镜结构解析工作中，目前有相当大的一部分时间和人工都消耗在重复性工作中，例如电镜胶片的拍摄和扫描，电镜图像的预筛选，三维重构计算中的某些步骤等。近年来，随着冷冻电子显微学的蓬勃发展，可以达到的分辨率越来越高，相应地对电镜数据量的需求也越来越大。以核糖体结构解析为例，获得10?分辨率的核糖体结构需要10万个冷冻电镜单颗粒。而在理论上，获得原子分辨率（好于3?）则至少需要100万个单颗粒电镜图像。如果以目前普遍使用的手动方式来进行数据采集和处理，那么仅仅电镜胶片的拍摄、扫描，以及电镜图像的预筛选等工作就需要数月之久！这实际上已经成为阻碍当前高分辨率的冷冻电镜结构解析的主要瓶颈之一。解决这一问题的有效途径就是开发高通量、全自动化的电镜数据采集和处理方法以及高性能的三维重构算法，以最大程度地提高对超大电镜数据量的采集和处理的效率，减少在这些方面耗费的人工和时间。 自动化的电镜数据采集系统对电镜的稳定性和计算机控制下的可操作性要求很高。特别是开发基于单颗粒重构方法的自动化采集系统，要求能够自动识别大量的适合成像的样品区域并长时间持续监控。由于开发难度很高，目前国际上在这一前沿领域的工作才刚刚开始，而真正能够实现全自动化数据采集的系统更是屈指可数。由本项目研究人员雷建林教授在过去数年中主持开发的AutoEMation是其中的佼佼者。与传统的手工采集方法相比，AutoEMation的巨大优势是能够对单个样品进行长达数日甚至数周的持续数据采集。以多输出通道的4kx4k CCD相机为例，24小时内可至少收集2000张电镜照片，比手工采集效率高十倍以上。此外，AutoEMation还能自动地在低电子辐照剂量下根据样品情况选择在同一个孔洞中的不同区域多次拍摄，从而大大提高了样品的利用率。而这在手工电镜数据采集中是无法做到的。AutoEMation目前已经在哥伦比亚大学、德州大学休斯顿医学中心、哈佛大学等多家冷冻电镜研究机构全面运转或试运转，并已多次稳定地对单个样品进行数据采集一周以上，迄今共收集十余万张CCD照片。 在本课题中，我们将在AutoEMation现有的核心构架的基础上，开发一套完备的高通量和全自动化的电镜数据采集和处理系统。首先，针对目前AutoEMation还只能运行在美国FEI公司的Tecnai系列冷冻电镜上的限制，将其扩展到我们刚刚在清华大学和中科院生物物理所购置的Titan Krios冷冻电镜平台上。需要指出的是，目前还没有任何针对Titan Krios冷冻电镜的自动化数据采集系统。我们在这方面的工作将是国际上最前沿的。其次，将AutoEMation扩展至具有支持单颗粒采集，倾转系列数据采集（包括电子断层分析和单颗粒倾转）等多项重要冷冻电镜操作功能。最后，在自动化数据采集的基础上，实现对电镜数据的预处理、预筛选，并由此探索和优化电镜样品的理想处理和数据收集条件，如包埋冰层的最佳厚度、电子束的最佳辐照强度和最佳欠焦范围等。 冷冻电镜图像的三维重构有很高的计算需求，特别是其中alignment和refinement的计算部。在10年前，这些计算任务主要是在具有共享内存架构和多处理器的专用计算机上完成。随着对分辨率的要求越来越高，所需要处理的电镜图像的数量呈指数增长趋势。因此，过去那种依赖于昂贵的专用计算机的数据处理方式已不再可行，而需要采用以LINUX为操作系统的计算机集群。在本课题中，我们将会针对高性能并行化这一需求对相关三维重构算法进行优化。以目前在国际冷冻电镜领域应用最广泛的三维重构系统SPIDER（System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields ）为核心，开发自动化的电镜数据处理系统。并将利用数据库集中管理从样品制备、电镜数据采集、数据分析、一直到三维重构的全套过程，以实现对一个完整的电镜结构解析项目的高效管理和处理。 开发和优化结构不均一性存在条件下的高性能分类方法，并应用于研究生物大分子复合体的动态过程和功能 结构不均一性是指由于生物大分子复合体自身结构的内在灵活性，在采集到的同一组冷冻电镜数据中经常包含着它们不同的结构构象。目前，结构不均一性影响冷冻电镜结构的分辨率已是一个普遍存在的问题。这主要是由于生物大分子复合体往往有多个与功能相关的结构共存，通过实验手段很难将它们分离。因而在采集到的冷冻电镜照片中，不同的单颗粒可能代表不同的功能态结构，它们之间结构的差异将直接降低三维重构密度图的