[参考】基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法.Doc

一、研究内容 1、拟解决的关键科学问题 （1）利用酪氨酸、亮氨酸和吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，以及大肠杆菌和酵母筛选系统，在蛋白质中特定位点引入特殊的非天然氨基酸，包括荧光氨基酸、具有生物正交化学反应性能的非天然氨基酸、高效率的光交联氨基酸、较大双光子吸收截面的光转化氨基酸、磷酸化的氨基酸、含有19F或自由基的氨基酸等。 （2）针对已有筛选系统效率不高的问题，发展结构生物学和计算生物学的方法，为筛选体系建立理论指导。 （3）发展和优化以“无铜点击化学”为代表的活体蛋白质特异正交标记技术。 （4）发展和优化氟取代化学反应，以期在蛋白质中引入19F探针，并优化荧光标记基团的性能。 （5）发展蛋白质特异标记方法，揭示哺乳动物细胞和线虫细胞的运动机理。 （6）拓展蛋白质特异标记方法，发现药物新靶标，优化蛋白质药物的靶向性和半寿期。 2、主要研究内容 本项目的主要研究内容是以在蛋白质特定位点插入非天然氨基酸为主要研究手段，结合超高分辨率荧光成像、核磁和顺磁共振技术和结构生物学、蛋白质组学技术，深入研究细胞生物学和医药学研究中所涉及的重要科学问题。 （1）基因编码非天然氨基酸筛选平台的构建 通过人工进化的方法增加编码非天然氨基酸。首先把无义密码子“UAG”确定为新的遗传密码，进而对天然的转运核糖核酸（tRNA）基因突变,使其含有反密码子“CUA”。在此基础上从氨酰-tRNA合成酶突变库中，筛选出可专一结合这种tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。然后再将生命体中mRNA上任意一个遗传密码取代为UAG,并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，从而在蛋白质中的相应位置插入具有特殊物理或化学性质的非天然氨基酸。其简要技术路线见图1: 图1：基因编码的非天然氨基酸的总体技术路线 二、预期目标 1、总体目标 本项目的总体目标是针对蛋白质科学前沿问题，设计和建立新的非天然氨基酸表达体系，将具有特殊物理、化学性质的非天然氨基酸表达到活细胞中目标蛋白质的特定位点，并通过系统优化，推动该方法成为实验室常规技术，使我国在该技术及应用方面跻身于国际前列。 2、五年预期目标 （1）突破性进展 通过本项目的实施，我们将在蛋白质特异标记的技术、理论和方法等方面取得突破性进展： ① 系统建立在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及线虫活体中具有普适性的引入非天然氨基酸的方法，全面发展荧光、核磁、光交联、光转化和磷酸化等蛋白质特异标记技术。 ② 将蛋白质特异标记技术应用于超高分辨率荧光成像，特别是通过优化蛋白质荧光标记技术，力争使我们的空间分辨率的定位精度达到10 nm，并做到实时活体观察。 ③ 将蛋白质特异标记技术应用于细胞运动的分子机理研究和药物靶标发现等，为我国在生命科学基础研究领域和药物研发应用领域带来重大突破。 （2）研究成果 ① 通过基因密码的扩展，大力发展蛋白质荧光、核磁、顺磁、光交联、光转化和磷酸化标记技术，并将这些技术结合遗传学操作，应用于超高分辨率荧光成像、蛋白质动态相互作用、蛋白质磷酸化网络调控、细胞运动的分子机理探索。 ② 在蛋白质翻译机理方面，从结构生物学的角度解析氨酰tRNA合成酶与tRNA和底物氨基酸特异作用的机理，指导基因密码扩展技术的研究。 ③ 发展以金属催化引入氟元素的方法学研究，对探索合成新型小分子荧光探针或非天然氨基酸，直接氟代蛋白质等提供化学手段的支撑。 ④ 建立一种通用方法，将非天然基酸引入到活病毒的包膜蛋白上，开辟病毒受体发现的新途径。 ⑤ 取得一批具有国际影响力的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表论文50篇以上，并力争在最高影响力的Science或Nature系列期刊上发表论文，发现1-2个在病毒和细菌感染中起重要作用的药物靶点，申请国内外发明专利6项以上。 ⑥ 培养一批有国际影响力的中青年学术带头人和学术骨干，培养博士研究生30名、硕士研究生60名。 ⑦ 系统优化蛋白质特异标记技术，为全国蛋白质研究提供一个全新的独特的研究方法，全面推进细胞生物学、化学生物学和医药学等领域的研究进展。 三、研究方案 1、总体思路 Genetically Encodable Small Molecule Labeling, GESML)，实现对活体细胞蛋白质的定点、特异和低干扰度标记。侧链上含有化学活性官能团的非天然氨基酸将以“遗传性标签”(Genetic tag)的形式嵌入活体蛋白质当中，并随后通过生物正交反应与小分子标记物特异结合。这一方法有效地融合了现有各种标记手段的优势，在保持高特异性的基础之上，最大限度地模拟目标蛋白质的原有自然状态，为精准和严格的蛋白质标记需求提供一类有效的工具。含有叠氮基团的非天然氨基酸将作为验证这一方法的切入点。 在此基础上，我们将把GESML技术应用到GPC