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LOGO LOGO 生物化學實驗 蛋白質變性沉澱與管柱層析 蛋白質基本架構 1 蛋白質沉澱原理 2 蛋白質純化 3 管柱層析 4 實驗 5 蛋白質基本架構(backbone) 蛋白質(Protein) 蛋白質中胺基酸，除-NH3+,-COO-二端，其它殘基之側鏈基團，亦可彼此鍵結，或和游離離子、水鍵結，若蛋白質和蛋白質間作用力大於蛋白質和水之作用力，則蛋白質沉澱，反之溶解。 蛋白質基本架構 1 蛋白質沉澱原理 2 蛋白質純化 3 管柱層析 4 實驗 5 原理 蛋白質由胺基酸所組成之帶有正負電荷的大巨大分子，當於水溶液中時，表面的電荷會與水分子以氫鍵形式進行鍵結並形成水合層，使得蛋白質以膠體粒子形式溶解於水中。當特定的物理或化學因子介入後，造成蛋白質膠體粒子趨向電中性，或破壞蛋白質表面之水合層時，經由降低其溶解度導致蛋白質沉澱。常見的蛋白質沉澱反應可區分為可逆性沉澱反應與不可逆性沉澱反應。 蛋白質沉澱 可逆性沉澱反應意指在不破壞蛋白質結構為前提下，改變蛋白質的溶解度，使之沉澱。 例如:鹽析、等電點、有機溶劑…… 不可逆性的沉澱反應則是利用破壞蛋白質的結構，進而改變其帶電性與形成水合層的能力，導致蛋白質不溶於水中。 例如:加熱、強酸、強鹼、重金屬…… 蛋白質基本架構 1 蛋白質沉澱原理 2 蛋白質純化 3 管柱層析 4 實驗 5 蛋白質純化 鹽溶鹽析 膠體過濾法 離子交換法 親和層析法 純化策略 蛋白質 純化方法 鹽對蛋白質溶解度的影響 鹽溶 Salting-in: 加鹽使蛋白質溶入水溶液中 鹽析 Salting-out: 加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來 鹽溶 (salting in) 鹽析 (salting out)-硫銨分化 蛋白質基本架構 1 蛋白質沉澱原理 2 蛋白質純化 3 管柱層析種類 4 實驗 5 膠體過濾法 離子交換法 親和層析法 純化策略 蛋白質基本架構 1 蛋白質沉澱原理 2 蛋白質純化 3 管柱層析 4 實驗 5 蛋白質沉澱-硫銨分化 藥品 新鮮雞蛋、飽和硫酸銨溶液 器材 紗布、燒杯、50mL離心管 實驗步驟 (改8000 rpm) 分子篩-蛋白質純化 藥品 10% 磷酸緩衝液 Sephadex G-75 20% EtOH 白蛋白樣品液 器材 塑膠滴管 脫脂棉 1.5 mL eppendorf 試管鐵架 管柱之填充與清洗: 取適量脫脂棉填塞於管柱底部。 以 20% EtOH 充滿管柱內部。 將 Sephadex G-75 樹脂緩緩加入管柱中，並調整樹脂的填充高度。 管柱以10% 磷酸緩衝液 流洗 3 mL 後備用。 實驗步驟 管柱充填 蛋白質樣品分離與純化: 將已填充 Sephadex G-75 樹脂之管柱垂直固定於試管鐵架上。 以10% 磷酸緩衝液流洗管柱，使最上層樹脂舖平。 待樹脂上層之 buffer 皆進入管柱的同時，立即將 2 mL 白蛋白樣品緩緩平舖於樹脂上（不可擾動樹脂），以1.5 mL eppendorf開始收集流出液。 待白蛋白樣品皆進入管柱中時，立即於樹脂上層加入10% 磷酸緩衝液（不可擾動樹脂），充滿管柱上部空間。 待第一管流出液收集 1.5 mL後，隨後以每 100 mL 為單位，連續收集。 將各管收集液於下周進行蛋白質定量分析，並計算蛋白質濃度(mg/mL)。 LOGO LOGO