医学遗传学与分子生物学实验.docVIP

实验一 哺乳动物基因组DNA的提取 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究以及基因诊断的重要步骤，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温冻存的组织细胞中提取，以前常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的，现在已开发出专门用于提取基因组DNA的试剂盒。通过这一方法获得的DNA不仅酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 实验目的 了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤。 实验原理 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA。 实验仪器和材料 1．DNA提取试剂盒（BBI）：内含TE水，细胞裂解液，沉淀液，1.2M的NaCl，蛋白酶K，RNase A 预冷的无水乙醇，70%乙醇，氯仿 3．超声波细胞粉碎仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅 实验步骤 1．取100mg小鼠脾脏组织，加入200μl的TE，用匀浆器充分匀浆。 2．加入400μl的细胞裂解液，充分混匀，再加入6μl的蛋白酶K，55℃孵育10分钟，中间偶尔混匀。 3．加入600μl的氯仿，轻柔混匀，高速离心（﹥10000rpm）2分钟，此时样品应该分为三相，而基因组DNA在最上面一相中。如果未能分成以上各相，那就是样品与氯仿之间未能混合均匀。 4．将500μl上清移入一新的1.5ml离心管中，加入500μl的沉淀液，混合均匀，室温放置2分钟，高速离心2分钟。 5．弃上清，将沉淀重溶于100μl 1.2mol/l的NaCl中，轻弹，直至沉淀完全溶解，再加入3μl的RNase A，37℃孵育10分钟。 6．加入300μl预冷的无水乙醇，混匀，并在-20℃放置10分钟。高速离心5分钟，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀，离心弃上清，空气中干燥10分钟。 7．将沉淀溶于100μl的TE中，37℃孵育2小时，-20℃保存。 注意事项 1．所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。 2．所有试剂均用高压灭菌双蒸水配置。 3．用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。 4．用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。 作业与思考 1．如何防止DNA的降解？ 2．蛋白酶K和RNase A的作用是什么？ 3．如果DNA降解成小片段，电泳时会出现什么样的电泳图象？ 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度于相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 实验仪器和材料 0.8%琼脂糖凝胶（含EB），1×TBE电泳缓冲液，凝胶成像仪，DNA标准带（DL-2000），水平电泳槽，电泳仪，小鼠基因组DNA 实验步骤 一、制备琼脂糖凝胶 按照被分离的DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。 1. 称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100ml 1×TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。 2.取出制胶板,洗净晾干,将制胶板放于水平位置,并放好样品梳子。 3.待胶冷至60℃左右时加入EB 5ul，摇匀，缓缓将凝胶倒入制胶板内。 4.待胶凝固后，取出梳子。 二、电泳加样 用移液器吸取10 ul已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔。 三、电泳 接通电泳槽和电泳仪的电源，最高电源不超过5V/。 当溴酚蓝染料移动至加样孔3 cm处时，停止电泳，将凝胶放在紫外灯下观察。DNA存在处应显示出亮荧光条带。 注意事项 1. EB为致畸、致癌变物质，注意防护。 2. 制胶时注意不要形成气泡。 3.电泳时注意正负极，DNA片段从负极向正极移动。 作业与思考 如果电泳过度会出现什么情况？ 实验三 PCR基因扩增 实验目的 学习PCR反应的基本原理和实验技术 实验原理 PCR反应的基本成分包括：模板DNA 待扩增DNA 、引物、4种脱氧核苷酸 dNTPs 、