厌氧性细菌的分离培养法 厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长.docVIP

厌氧性细菌的分离培养法 厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至0.11V时才开始生长 ，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学3种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。1．生物学方法培养基中含有植物组织 如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 或动物组织 新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等 ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气 如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理 ，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌 如枯草杆菌 ，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。（１）李伏夫 B．M．JIbbob 法此法系用连二亚硫酸纳 Sodium hydrosulphite 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 如系液体培养基，则直立于罐内 ，最上端保留可容纳1~2个平皿的空间 视玻罐的体积而定 ，按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 如图１－５ 。（２）焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大重氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙 Purpurgallin 。每l00cm3空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化纳或氢氧化钾l0ml，其具体方法主要有下列几种：1）单个培养皿法：将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在其上放焦性没食子酸0.2g及10％NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人37C温箱培养24~48h后，取出观察。2）Buchner氏试管法：取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放人大试管中，迅速加入20％NaOH溶液0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石蜡，37培养24~48h后观察 图１－６ 。３） 玻罐或干燥器法：置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后．将线放下，使焦性没食子酸落人氢氧化纳溶液中，立即将盖盖好；封紧，置温箱中培养。４）瑞 Wright 氏法：将已接种细菌的培养管的脱脂棉塞在火焰中烧灼灭菌后，塞人管中离培养基1~1．5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10％NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养 图１－７ 。５）史 Spray 氏法：用图１－８所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置氢氧化钠溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封完全，然后摇动底部，使氢氧化钠溶液与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。６）平皿法：置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封固后，置温箱中培养（图１－９）。７）硫乙醇酸钠法 硫乙醇酸钠 HSCH2COONa 是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原性物质，促使厌氧菌生长。其他可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C、半胱氨酸等。A．液体培养基法：将细菌种人含0.1％的硫乙醇酸钠液体培养基中，37℃培养24~48h后观察，本培养基中加美蓝液作为氧化还原的指示剂，在无氧条件下，美蓝被还原成无色。Ｂ．固体培养基法：常采用特殊构造的Brewer培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落；操作过程是先将Brewer氏皿干热灭菌，将溶化且冷却至50℃左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾人皿内。待琼脂冷　　　凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿