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葡萄籽提取物抗氧化及抑制脂肪酶活性研究 　　[摘要]：原花青素是生物类黄酮 ，广泛应用于食品、药品、化妆品等领域 。本文以葡萄籽提取物为主要原料，验证其具有抗氧化活性和抑制脂肪酶活性。 　　[关键词]：原花青素 抗氧化 　　1.原花青素的化学构成 　　1.1葡萄籽提取物组成成份 　　葡萄籽提取物中所含的原花青素是由儿茶素、 表儿茶素及其没食子酸酯通过C4-C6或C4-C8 键共价相连的多聚体。常把二聚体～四聚体称为低聚体。五聚体及五聚体以上的称为高聚体。 　　1.2 原花青素的主要性质 　　原花青素的主要性质： 　　原花青素在热酸条件下能够生成红色的花青素，原花青素的最大吸收波长在280nm附近 使其具有较强的紫外吸收能力，此性质可用于原花青素的定性和定量分析。结构中具有较多的羟基 ，具有较大的极性 ，使其能够很好的溶解于水 、甲醇、 丙酮 、乙醇等极性溶剂而不溶解于苯、 氯仿 、石油醚等非极性物质。 　　2.试验材料与设备 　　2.1 试验材料 　　抗氧化试验：①DPPH·溶液以无水乙醇配制；②GSPE溶液以无水乙醇配置③具体配制方法：将20mgDPPH·溶于500ml容量瓶中定容；将200mgGSPE用无水乙醇溶解于500ml容量瓶中定容。 　　抑制脂肪酶活性的实验：①缓充液的配制，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液（PH值为5.91，6.47，6.98，7.38，8.04）。②脂肪酶溶液的配制：用分析天平称取一定量的酶粉于研钵中，加入少许水研磨成糊状，再加一定量50m mol. L - 1磷酸盐缓冲液（pH=7.0）溶解，离心后取上清液储于4℃以下的冰箱中备用。本实验选用的浓度均为5mg/ ml 。③显色剂的配制：配制5%醋酸铜溶液，用吡啶调节至pH =6.1，既得脂肪酸显色剂。④抑制剂的配制：200mgGSPE溶解于500ml 容量瓶中定容。 　　2.2 试验设备 　　UV - 1601紫外可见双光分光光度计；500ml容量瓶；分析天平；80ml锥形瓶；恒温摇床等。 　　2.3 试验方法 　　2.3.1抗氧化活性试验 　　（1）方法选择：广义的抗氧化剂是指自由基及活性氧的清除剂、阻断剂及修复剂等物质的总称。通过测定植物提取物清除自由基的能力也能表明其抗氧化能力的强弱 ，研究自由基的检测方法并探讨物质对自由基的清除作用也有重要意义。迄今用于评价植物抗氧化能力的方法虽已有诸如硫氰酸盐 thiocyanate 法、硫代巴比妥酸 TBA 法、ORAC法 automated oxygen radical absorbance capacity assay 等 是这些方法或者所需试剂或大型仪器的费用昂贵 ，尚缺乏一种灵敏、简单易行的有效方法。DPPH·分光测定法的测定原理是依据 DPPH·在 517nm处有一强吸收，其乙醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时 ，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失 ，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系。因而可用分光法进行定量分析。国外已有很多的学者用此法研究了物质清除自由基的性质 。 　　2.3.2抑制脂肪酶活性试验 　　①脂肪酸吸光度工作曲线的制定： 　　配置一系列不同浓度的油酸/苯溶液，分别取4ml于锥形瓶中加1ml显色剂，磁力搅拌3分钟，油酸分子与Cu2 +生成绿色的络合物，离心后取上层有机相在710nm 下测定吸光度.用未加油酸的空白溶液作参比以吸光度对油酸浓度作图，得一直线，既为脂肪酸吸光度工作曲线： 　　A= -0.037+0.3051X其中X为油酸浓度R2=0.9991。 　　②脂肪酶活力测定： 　　用胶管将反应器与恒温槽连接，并调节恒温槽温度至37℃.取3ml50m mol.L-1磷酸盐缓冲液（pH=7.0）和1ml 橄榄油于反应器中，预热5分钟.然后用微量进样器注入0.1ml 酶溶液，磁力搅拌10分钟，立即加8ml 苯，继续搅拌2分钟，终止反应，同时萃取生成的脂肪酸.。将溶液转移至离心试管中，在4000r/min下离心10分钟，有机相和水相分层澄清.取上层有机相4ml于小锥形瓶中，加1ml显色剂在磁力搅拌器上搅拌3分钟，产生的脂肪酸与Cu2+生成绿色络和物。取上层含有脂肪酸铜的苯溶液，用分光光度计在710nm 波长下测其吸光度以同法制备但不含脂肪酶的空白溶液为参比，对照脂肪酸吸光度工作曲线，既可求得脂肪酸的浓度.由脂肪酶活力定义得活力计算公式。 　　③酶活定义及计算公式： 　　脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmol脂肪酸的酶量定义为1个脂肪酶活力单位（U）。 　　按下式计算酶活： 　　X=cV/tV′式中：X为脂肪酶活力，U·mL-1；c为脂肪酸浓度，μmolmL-1；V为脂肪