DNA的转化与筛选、质粒提取和酶切技术总结.ppt

DNA的转化与筛选、质粒提取和酶切分析 外源ＤＮＡ的转化及转化子的筛选 一．实验背景 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆或表达质粒载体， 并确定重组方案后，获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达，质粒ＤＮＡ可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株，可广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。 转化 Transformation 是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化中所用的受体细胞 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。 大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。 1．实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 TSS溶液处理受体菌使其处于为感受态，然后导入质粒PET-15b，实现转化。 PET-15b质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基（ALB 上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。 感受态细胞的制备方法 重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细胞内。这项技术始于Mandel 和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2 溶液处理及短暂休克后，容易被λ噬菌体DNA感染。随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。 其原理是：细菌处于0℃ ，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子 除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细胞。 在本次实验中用的是TSS二步法转化细菌，本方法在致敏缓冲液中没有CaCl2，而是由 Mg2+ 代替，联合聚乙二醇（PGE 和二甲基亚砜（DMSO），适用于此法的菌株广泛。 1×TSS 致敏缓冲液 10％ 聚乙二醇（ PGE 5％ 二甲基亚砜（DMSO） 50mmol/L MgCl2 三．实验方法 1×TSS二步法转化宿主菌 1 将摇起的DH5α 1：100活化，摇2～3h，至成淡云雾状。使细菌处于对数生长期。 2 将菌冰浴10～15分钟，，各取1ml菌液加入EP管内，4000rpm 离心2分钟，弃上清。 3、加入100μl 1×TSS 溶液，轻柔吹打。 4、加入连接产物（质粒2μl）轻轻混匀，冰浴40分钟，勿振。 5、42℃热休克90秒 6、冰浴30秒。 7、于EP管内加入100μl LB培养基，37℃，130rpm震摇30分钟。 8．取50～100μl涂布于含Amp 50μg/ml 琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。 2.重组子的筛选 受体菌质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法： １．抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。 ２α互补法 现在使用的许多载体，有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和N端１４６个氨基酸编码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端氨基酸的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色