实验四叶绿体色素的提取与测量.docVIP

实验四 叶绿体色素的提取与测量 一、叶绿体色素的提取与分离 ( 一 ) 目的 明确叶绿体色素的种类及其提取和分离的方法。 ( 二 ) 原理 高等植物的叶绿体中含有叶绿素 ( 叶绿素 a 和叶绿素 b) 和类胡萝卡素( 胡萝卡素和叶黄素 )。这两类色素均不溶于水,而榕于有机洛剂,故常用酒精或丙酮提取。提取液中的叶绿体色素可用层析法加以分离,因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当 用适当洛剂推动时,不同物质的移动速度不同,便可将色素分离。 ( 三 ) 用品与材料 托盘天平、培养皿、滤纸、玻棒、烧杯、漏斗、研钵、滴管、漏斗架、坩埚、三角瓶、剪刀、 95% 酒精、汽油、碳酸钙、无水碳酸钠、石英砂。 ( 四 ) 实验步骤 1. 色素的提取。将剪碎的鲜叶 8～10g 放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及 95% 酒精 5～10ml 研磨成糊状,再加入 20ml 左右的酒精,充分混匀,以提取匀浆中的色素,3～5min 后,过滤人三角瓶中,加 1Og 左右元水碳酸纳以除去提取液中的水分,将提取液转入另一三角瓶中,加塞待用。 干叶提取,可先取植物新鲜叶片在 105 ℃下杀青，再在 70～80 ℃下烘干，研成粉末 ( 如不及时用, 可避光密闭贮存)。称取叶粉 2g, 放入小烧杯中，加人 95% 酒精 20～30 时，进行浸提 ，浸泡中需要用玻璃棒经常搅动，如气温过低亦可在水浴中适当加热。 待酒精是深绿色时，将溶液过滤到另一烧杯或三角瓶中待用。 2. 色素的分离。取一圆形滤纸，在其中心戳一圆形小孔。另取一张滤纸, 剪成长 5cm 、宽 1.5cm 的纸条, 将它捻成纸芯。将纸芯一端蘸取少量提取液使色素扩散的高度限制在 0.5cm 以内, 风干后再蘸, 反复操作数次。然后将纸芯蘸有提取液的一端插人圆形 滤纸的小孔中, 使与滤纸刚刚平齐 ( 勿突出 )。埔塌内加适量元色汽油, 把插有纸芯的圆 形滤纸平放在上, 使纸芯下端浸入汽油中 , 进行层析。这时纸芯不断吸上汽油，并把其上 的色素一起沿滤纸向四周扩散，不久就可看到被分离的各种色素的同心圆环 , 叶绿素 b 为 黄绿色, 叶绿素 a 为蓝绿色, 叶黄素是鲜黄色, 胡萝卡素是橙黄色。用铅笔标出滤纸上各种色素的位置并注明其名称。 （ 五 ) 注意事项 1. 用于色素分离的提取液浓度应高些, 蘸取提取液的速度不直太快, 风干后再蘸,浓度不高时分离效果较差。 2. 分离图可在暗中保存 , 以免色素被光氧化。 ( 六 ) 作业记录以上各项结果,并加以解释。 二、叶绿体色素的理化性质 ( 一 ) 目的 从光合色素的结构出发, 认清叶绿体色素的主要理化性质及观察方法。 ( 二 ) 原理 叶绿素是一种二竣酸的酯, 可与碱起皂化作用, 产生的盐能溶于水中。 以此法将叶绿素和类胡萝卡素分开。叶绿素与类胡萝卡素都具有共轭双键，在可见光区表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变为激发态的叶绿素分子很不稳定, 当它回到基态时, 可以发射出红色荧光。叶绿素分子中的镜可被 H+ 所取代而成为褐色的去镁叶绿素, 后者遇到 Cu+ 可形成绿色的铜代叶绿素, 这种铜代叶绿素在光下不易受到破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸制标本。 ( 三 )用品与材料 分光镜、铁三角架、研钵、分液漏斗、酒精灯、石棉网、滴管、小烧杯、试管、试管架、玻棒、移液管、95% 酒精、石油醋、醋酸铜粉、氢氧化锦片、50% 醋酸。 ( 四 ) 方法与步骤 将本实验第一项中提取的叶绿体色素溶液用95% 酒精稀释一倍，进行以下实验: 1. 皂化作用。吸取叶绿体色素提取液 5ml 放入试管内, 再加人少量氢氧化钾片，充分摇匀, 片刻后, 加入 5ml 石油醚, 摇匀, 再沿试管壁慢慢加入 l～1.5ml 蒸溜水, 轻轻摇匀, 静置试管架上, 随即可看到溶液逐渐分为两层, 下层是酒精溶液, 其中溶有皂化叶绿素 a 和叶绿素 b ( 还有少量叶黄素 )；上层是石油醚溶液, 其中溶有黄色的胡萝卡素和叶黄素。 将上下两层溶液用分液漏斗分离，分别装人试管内，加塞放于暗处，以供观察吸收光谱用。 2.H+ 和 Cu+ 对叶绿素分子中镁的取代作用。吸取叶绿体色素提取液约5ml放人试管中, 加入 50% 醋酸数滴，摇匀后，观察溶液的颜色有何变化。 当试管中溶液变成褐色后，倾出一半于另一试管中，投入醋酸铜粉末少许，微微加热，然后与未加醋酸铜的试管比较，观察颜色有何变化。 3. 叶绿素的荧光现象。取较浓的叶绿体色素提取液 5ml, 放人试管中 , 观察光线透过叶绿素提取液和叶绿素提取液在暗背景下的反射光的颜色有何不同? 4. 叶绿体色素的吸收光谱。先调试分光镜, 伸缩分光镜的望远镜筒, 使彩色光谱清晰可见 , 然后把叶绿体色素提取液