慈雕科鱼类法朗西斯样菌感染症之研究.doc

慈雕科魚類西斯樣菌感染症之研究Study on Francisellosis in Cichlid Fish 研究生：謝嘉裕 Hsieh, Chia-Yu 指導教授：蔡信雄 Tsai, Shinn-Shyoug 【摘要】 過去14年來國內淡水與半淡海水吳郭魚仍受到先前尚未鑑定之細胞內寄生菌的危害，對少部分養殖池甚至造成高達95%的死亡率。該細胞內寄生菌型態呈現多型性，可利用鮭魚胚胎細胞（Chinook salmon embryo cell line, CHSE-214）及吳郭魚卵巢細胞Tilapia ovary, TO-2）加以培養，但是無法生長於例行性人工配製之培養基，為立克次氏樣菌（rickettsia-like organism, RLO）或吳郭魚細胞內寄生菌（tilapia intracellular organism, TIO）。許多研究學者認為他應該與鮭鱒魚類立克次氏菌（Piscirickettsia salmonis）一樣是絕對細胞內寄生菌。藉由電子顯微鏡觀察及細菌16S rDNA（rRNA）基因序列親緣關係分析，先前所謂 RLO/TIO與朗西斯屬病原極為接近，是一尚未鑑定及分類的新種朗西斯屬病原菌。本論文著重於該病原菌（Francisella-like bacterium, FLB）特性描述及鑑定方法。貫穿上下文約略分為三個部份。首先運用聚合鏈鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）針對分離出之10株病原株之16S rDNA（rRNA）基因序列進行分析，並配合電子顯微鏡觀察及描述其生化特性。FLB 生長速度較為緩慢，一般培養在Thayer-Martin agar上於23℃下需要3至6天。生長之菌落呈現光滑灰白色色澤。最適合之生長溫度介於23至28℃，而無法於35℃以上生長。FLB為絕對需氧菌，不具運動性，nitratebeta-galactosidase和resazurin還原反應為陰性，可、ONPG、L-arabinoside、leucine和glycine。Catalase弱陽性但是對β-lactamase、proline和sucrose呈強陽性。比對其16S rRNA 基因全長與F. philomiragia、F. tularensis subsp. novicida及F. tularensis subsp. tularensis相似度分別達98.7%、97.4%與96.2%。此外，並原位雜合反應（in situ hybridization, ISH）加以確診。第二部份探討利用PCR技術將自行設計之FLB種別特異引子對（FLBspecific primers）配合朗西斯屬通引子對（Francisella genus-specific primers）進行多種朗西斯屬細菌屬（genus）、種（species）及亞種（subspecies）之區別，結果證實自行設計之FLB種別特異引子對能夠明確運用於F. tularensis、F. novicida和F. philomiragia區別。第三部份證實慈科觀賞魚亦會感染FLB，感染部位以消化道最多。福馬林固定及石蠟包埋之組織利用組織病理學、PCR及ISH檢測結果相較下，ISH 檢測之敏感度高於PCR及組織切片檢查。慈科魚類西斯樣菌立克次氏樣菌聚合鏈鎖反應原位雜合反應Over the course of the past 14 years, an unrecognized intracellular organism has emerged from fresh- and brackish- cultured diseased tilapia and causing high mortality, up to 95% in some cases in Taiwan. The causative agent is a cocco-bacillus with a polymorphous shape, and can be cultured in Chinook salmon embryo cell line CHSE-241 and Tilapia ovary TO-2 cells, but does not grow on artificial synthetic media, which was named rickettsia-like organism RLO or tilapia intracellular organism TIO . Therefore, many researchers suggest it is an obligate intracellular bacterium, such a