猪脂肪基质细胞成骨与成脂分化潜能的研究.doc

猪脂肪基质细胞成骨与成脂分化潜能的研究* 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25 11 :37～40 屈长青张国华赵丽丽杨公社** （西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室杨凌712100） 摘要目的:探索猪脂肪基质细胞体外培养和向成骨与脂肪细胞分化的条件。方法:常规方法培养猪脂肪基质细胞,分别向成骨细胞与脂肪细胞进行诱导，应用免疫组化（碱性磷酸酶法、茜素红）及油红O染色对诱导分化的细胞进行鉴定。结果:在体外培养条件下，猪的脂肪基质细胞呈成纤维样,生长旺盛，在一定的条件下，可分别被诱导分化为成骨细胞与脂肪细胞,向成骨分化的细胞表达碱性磷酸酶，在培养皿中可形成钙化斑。而在向脂肪细胞诱导分化过程中，细胞中可见有小脂滴生成，用油红O染色呈橘红色。结论:脂肪基质细胞是一种混合细胞，除了能向脂肪细胞分化外，在一定的诱导条件下，也能向成骨细胞分化。 关键词猪脂肪基质细胞成骨细胞脂肪细胞 收稿日期：20050405修回日期：20050629 *国家自然科学基金资助项目 座机电话号码 ** 通讯作者，电子信箱：gsyang999@脂肪组织和脂肪细胞是近年来人们广泛探索的领域之一。这主要有两个原因：首先，越来越多的研究表明脂肪组织不仅仅是被动的能量库，而且其能分泌多种激素类物质，通过内分泌、旁分泌途径发挥调控作用；其次，2001年,Zuk等［1］从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中第一次分离获得了具有多向分化潜能的细胞，命名为PLA processed lipoaspirate 细胞。它能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞。由于获取脂肪组织要比骨髓容易，而且把原本认为是多余的废弃物（抽取的脂肪组织悬液）变为干细胞库的重要来源，这本身就具有极大的经济与社会效益，因此虽然发现较晚，但研究非常迅速与深入。目前已证实，从人、鼠及兔子等不同动物体内的脂肪组织中都能获得脂肪组织来源干细胞，并能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导转化［1~5］。但迄今为止，还没有从猪脂肪组织中获得间充质干细胞并进行诱导的报道。本试验旨在从猪脂肪组织中提取脂肪基质细胞，并向成骨细胞与成熟脂肪细胞进行诱导，对其诱导条件进行初步探索。 1材料与方法1.1材料 1.1.1脂肪组织杨凌农校种猪场1～3日龄仔猪，取材部位位于颈部和肩胛部皮下。 1.1.2主要试剂DMEM培养基和Ⅰ型胶原酶（GIBCO公司）；地塞米松、抗坏血酸和β甘油磷酸钠（Sigma公司）；胎牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（Amersco公司）；碱性磷酸酶试剂盒 南京建成生物工程研究所 。 1.2方法 1.2.1猪脂肪基质细胞的获得无菌状态下取仔猪颈部脂肪组织，用含高浓度青霉素（300U/ml）和链霉素（300ng/ml）的PBS缓冲液浸泡、冲洗2次。用眼科剪和眼科镊子去除脂肪组织块表面可见的血管与肌肉，最后剪成1mm3大小的碎块。用含0.1%Ⅰ型胶原酶的无血清DMEM培养液在37℃水浴振荡仪中消化60min；消化结束后用等体积的完全培养液 LGDMEM、10%FBS 中和消化液，消化物依次通过孔径为100μm和25μm的尼龙筛，收取过滤液，离心10min（300g）。弃上清及漂浮的成熟脂肪细胞，获基质血管层 stromal vascular fract ion, SVF ，加入红细胞裂解液，吹打均匀，室温静置10min。离心5min（300g），用完全培养液重悬细胞，再离心洗涤1～2次。然后，将消化分离出的细胞稀释，吹打均匀，以1×105个/cm2密度接种于培养瓶中。置于培养箱（37℃，饱和湿度，5%CO2）培养，24h后弃去培养液，用无血清的DMEM培养液洗3次，除去未贴壁细胞后换用新鲜的完全培养液。之后每2～3d换液一次。 1.2.2细胞传代培养原代培养至80%细胞致密层时，用0.25%的胰酶消化液，在37℃下，消化3～5min，等体积完全培养液终止消化，轻微吹打后转移至离心管中，离心5min（300g），弃上清，用完全培养液重悬细胞，按1∶3的比例进行传代接种培养。传代培养过程中，每2～3d换液一次。 2005, 25 11 屈长青 等：猪脂肪基质细胞成骨与成脂分化潜能的研究 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.11 2005 1. 3向成骨细胞的诱导分化 取第2代细胞按2×104个/ml 接种于35mm 培养皿中，接种24h后，更换培养液弃掉未贴壁的细胞，并加入诱导成骨分化的培养基 osteogenic medium，OM ，即在完全培养基中加入终浓度为0.1μmol/L的地塞米松，50μmol/L抗坏血酸和10mmol/L β甘油磷酸钠，诱导分化的第