质粒DNA测定验报告.doc

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 DNA的提取、定量与酶切鉴定 实验日期 2014--11 实验地点 第实验室 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 实验目的 二、实验原理） 1. PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。 加热使模板DNA，在高温下90℃-95变性，双链解链； 降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链； 溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 （二）DNA提取与定量 1.质粒（Plasmid） 独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子； 存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 2.碱裂解法、 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； 高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性； 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。 3.离心层析柱 硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质； 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 4.紫外光吸收法 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应； 而且物质对光的吸收是具有选择性的； 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。 （三） 1. 限制性内切酶 限制性内切酶（restriction endonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具； 特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA； 分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。 （四） 1. 天然琼脂 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％ 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷； 琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 2.基本原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度； DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动； DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。 三、材料与方法 菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T) 引物： 正向： 5’ GTA　AAA　CGA　CGG　CCA　GT 3’ 5’ CAG　GAA　ACA　GCT　ATG　AC 3’ 2×Premix TaqTaq酶：5U/μl 4×dNTP: 各10mmol/L 10×缓冲液（buffer）: 500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl 灭菌去离子水 含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α LB培养基（液体、固体） AXYGEN试剂盒质粒提取试剂盒（爱思进，中国） 溶液 P1（S1) 溶液 P2 (S2） 溶液 P3（S3） 去蛋白液 PE（W1) 漂洗液 WB(W2） 洗脱液 EB（Eluent) DNA Marker 电泳缓冲液 仪器与器材 PCR仪(BioRad MJ mini) 台式离心机 微量加样枪 灭菌的薄壁离心管 凝胶电泳系统 凝胶成像系统 恒温培养箱 恒温摇床 超净工作台 台式离心机 高压灭菌锅 （二）方法与步骤 部分 方法步骤 注意事项 1.注意每换一种试剂换一个新吸头) 2.如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)