Co-IP实验步骤.docVIP

免疫共沉淀实验步骤： 1 将转染质粒48 h后的293T细胞用冰1×PBS洗涤一次，加入1ml预冷的IP buffer裂解液（含PMSF），冰上30min裂解细胞。 2将细胞裂解液收集于1ml EP管中，在4℃ 12000rpm离心10 min，取上清，加入4μg 抗体于4℃振摇2h（抗体的量和振摇时间可根据抗体特异性适当调整）。（阴性对照组为相同的种属的抗体） 3 样本组和对照组中分别加入50 μl prorein A/G 树脂在4℃振摇过夜。用IP buffer洗涤3次，每次4℃ 12000rpm离心5min，弃上清。加入40μl 2×上样缓冲液。沸水中煮10 min变性蛋白。取20μl蛋白样品上样，在SDS后，转移质PVDF膜，用相应抗体进行检测。 IP buffer 20mM Tric-Hcl 137mM NaCl 10% Glycerol 1% Np-40 1mM EDTA 注意事项： （1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100 。 （2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 （3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG （4）吸取珠子的枪尖最好将口开大（剪掉尖头部分），以免损伤珠子。 5 确保共沉淀的蛋白是由