上海交通大学遗传学课件9标记检测和PCR汇总.pptVIP

实验九、DNA的PCR扩增及其检测 一、实验目的 了解聚合酶链式反应(PCR)的原理 掌握PCR实验的方法 PCR结果的检测 二、实验原理 (一)PCR的原理 PCR是以单链DNA为模板，四种dNTP为底物，利用寡核苷酸引物与模板3’端的特异性结合，在DNA聚合酶的催化下合成模板的互补链 PCR反应通常包括25-30个循环，每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成。假定扩增效率为1，经过30个循环后，目标DNA分子数将提高到起始时的1073741824倍（即230倍） 时间(min) 55 72 94 温度 (℃) 第n个循环 变性 退火 延伸 延伸 变性 Y=X(1+E)N Y:扩增后目标DNA分子数；X:起始时目标DNA分子数；E:扩增效率 (0≤E≤1)；N:扩增循环数 （在理想条件下） PCR的技术关键 引物设计、引物保存、防止污染、反应条件优化、…… PCR的衍生技术 反转录PCR、反向PCR、巢式PCR、原位PCR、多重PCR、多重等位基因PCR、不对称PCR、锚定PCR、荧光定量PCR、…… PCR的应用 基因克隆、DNA测序、定点突变、基因分型、疾病诊断、亲子鉴定、嫌犯验证、转基因检测、基因表达水平分析、…… PCR产物电泳(照片） 酶切产物电泳（示意图） (三)PCR产物检测的方法 三、实验材料和试剂 (一)PCR扩增 1.模板：番茄(Solanum lycopersicum)基因组DNA 2.引物： 3 番茄PCR反应体系（10μL） 成分 含量 F-primer 0.1μM R-primer 0.1μM DNA模板 20ng dNTPs 0.2mM MgCl2 5mM Taq聚合酶 0.5U 10×Buffer 1μL ddH2O 补充至10μL (一)PCR扩增试剂盒： ddwater 2 μl Premix Taq 5 μl 模板DNA 1 μl 引物 2 μl 总体积 10 μl ←番茄DNA ←正、反引物已预混 注意： (1)冰上操作 (2)混匀 (3)在管上做好标记（统一编号） PCR边缘效应：PCR仪边缘各孔的扩增效果稍差 1 11 21 31 2 12 22 32 3 13 23 33 4 14 24 34 5 15 25 35 6 16 26 36 7 17 27 37 8 18 28 38 9 19 29 39 10 20 30 40 2. PCR反应条件 （由教师设置） 94℃ 4分钟 94℃ 45秒 55℃ 45秒 72℃ 60秒 72℃ 7分钟 4℃ 30分钟 循环35次 预变性 变性 退火(模板～引物) 延伸(0.8-1min/kb) 延伸 降温(暂时保存) Ty-1酶切反应体系（10μL） * 成分 含量 TaqⅠ(Taq酶) 0.5μL 0.1%BSA 1μL 10×Buffer 1μL PCR产物 7.5μL 65℃酶切时间为2小时 琼脂糖凝胶电泳 制胶：称取1.2g琼脂糖，溶于100mL 1×TAE溶液中（微波加热至完全融化）；加入10μL的核酸染料；将混合均匀的液态胶倒入胶板，插好梳子待其凝固（约40分钟） 上样：一般第一个点样孔加入5μL的2000bp的Marker，往其它点样孔中滴入5μL的PCR产物或酶切产物 电泳：调节电泳仪电压为180V，电泳30-40min 保存：利用凝胶成相系统对胶板进行拍照并保存。 PCR产物的凝胶电泳 将目的片段与其它片段分开 五、注意事项 1.PCR反应液应在冰上配制，防止枪头和试剂污染 2.Buffer B2中含强变性剂，应避免与皮肤接触 3.