论文名称(中文) 生物二型创伤弧菌毒力质体中为该菌在鳗鱼血清中存活.docVIP

論文名稱 中文 生物二型創傷弧菌毒力質體中為該菌在鰻魚血清中存活所需基因之探討 論文名稱 英文 Determination of genes in biotype 2 Vibrio vulnificus virulence plasmid required for bacterial survival in eel serum 研究生 中文 武冠志 研究生 英文 Kuan-Chih Wu 中文摘要 創傷弧菌為一種革蘭氏陰性的弧狀桿菌，可以造成人類及鰻魚的嚴重感染症，並導致宿主的死亡。創傷弧菌菌株中，只有一部分能夠感染鰻魚，這一群菌株被分類為生物二型。我們實驗室之前的研究顯示，生物二型菌株感染鰻魚的能力跟其內專有的毒力質體pR99有關，而進一步使用大規模剔除質體上未知區域進行的分析則指出，此毒力質體所含的基因中，能夠幫助菌株在鰻魚血清中存活的基因可能有三個：vep07、vep20及vep71。然而，當把這三個基因以兩個質體送入生物二型質體剔除株進行回補時，卻無法恢復該菌在鰻魚血清中存活的能力。本研究的主要目標為確認創傷弧菌在鰻魚血清中生存的能力是否只需要毒力質體中這三個基因就能達成。首先，我確認了這三個基因中的vep07及vep20對於生物二型菌株生存在鰻魚血清中是很重要的，而vep71對於處於stationary phase的細菌很重要，而對於處在exponential phase的細菌而言不重要。之後，我藉由插入一組毒素-抗毒素系統到pBBR1MCS4此一和我們實驗室常用的pIT009相容，但是在創傷弧菌中穩定度不高的廣宿主性的載體，以提高其穩定度後，和pIT009搭配，建立了一個雙載體系統，讓我能夠藉以把這三個基因轉殖到創傷弧菌各菌株中，以進一步確認這三個基因對於創傷弧菌在鰻魚血清中生存的重要性。實驗結果顯示，當質體剔除株得到這三個基因之後，其在鰻魚血清中生存的能力就大幅的回升了；然而，當我將這三個基因送入生物一型菌株YJ016之後發現，同時得到三個基因的轉殖株在鰻魚血清中的生存能力大約只有生物二型的1/3左右，且和只得到vep71的轉殖株的生存能力相當，以即時偵測反轉錄PCR偵測這些基因的mRNA表現量及使用西方墨點法偵測Vep07的蛋白質表現，結果顯示在YJ016轉殖株中vep07及vep20的mRNA及Vep07蛋白皆可以被正常表現。因此，在這三個基因當，vep71對於YJ016在鰻魚血清中是最重要的，然而只有vep71仍然是不夠的，故我推論除了在毒力質體上的基因之外，可能有些位在生物二型染色體上的基因，也參與在細菌對鰻魚血清的抵抗能力中，而造成生物一型及生物二型菌株在鰻魚血清中生存能力的差異。 英文摘要 Vibrio vulnificus, a Gram-negative, curved-bacillus, may cause severe infectious diseases in both the human and eels. Only a fraction of V. vulnificus can infect the eels, and they are classified as biotype BT 2. We have previously demonstrated that the ability of BT2 V. vulnificus strains to infect eels is associated with a BT2 specific virulence plasmid. Further, by characterization of mutants with large sectional deletion in the virulence plasmid, pR99, of BT2 strain CECT4999, it was suggested that in this plasmid only vep07, vep20 and vep71, are required for bacterial survival in eel serum. However, the ability of pR99-cured strain complemented with these three genes to survive in eel serum was not observed. The aim of this study is to determine whether vep07, vep20 and vep71 together are sufficient to convey resistance to eel serum. First, I d