雄激素含量测定用蛋白微阵列的制备.docVIP

雄激素含量测定用蛋白微阵列的制备* 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(11):84～90 周勇1,2王伟1耿美玉2杜冠华1** (1 中国协和医科大学中国医学科学院药物研究所北京1000502 中国海洋大学海洋药物与食品研究所青岛266003) 摘要利用分子生物学技术对鼠雄激素受体结合域（rARLBD）重组表达，结合新兴的蛋白质微阵列技术建立了一种快速无污染的检测方法，用于临床雄激素检测及新药发现。实验将编码ARLBD的cDNA片段（888bp）插入到含有多聚组氨酸标签的表达载体pET32a中构建了表达质粒pET32a/AR，并将其转化到大肠杆菌BL21中。经IPTG低温诱导，得到高效表达的可溶性ARLBD融合蛋白产物，并通过NiNTA凝胶亲和吸附纯化。将纯化得到的ARLBD使用芯片点样仪固定到硅烷化－多糖表面片基，制备得到ARLBD蛋白质微阵列。实验得到的特异性结合曲线表明在微阵列上的受体蛋白能够保持功能构像。通过Scatchard方程计算得到微阵列上ARLBD与荧光标记的睾酮结合的Kd值为5.32nmol/L。浓度依赖性标准曲线表明这一方法有较高的灵敏度，最低检测限达1pmol/L。应用这一方法对224例健康中国老年人血清雄激素水平进行了测定，研究证明了该方法的可靠性，并首次提供了一定样本量的我国老年人血清活性雄