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DNA分子遗传标记技术在生药鉴定中的应用 摘要：概述了中药鉴定中应用的DNA分子遗传标记技术( 也称DNA分子遗传诊断技术)，就近些年利用DNA分子遗传标记技术对中药进行鉴定的最新进展进行综述。展望了DNA分予遗传标记鉴别在生药鉴定中的前景。 关键词：DNA分子遗传标记技术 生药鉴定 前言：我国药材资源丰富，据统计有1～2万余种，其中药用植物大约有10 000多种(包括中药约600种)，它们是我国人民防病治病的重要资源，同时也是寻找和开发新药的宝库[1]。药用植物是传统中药的重要来源，其研究必须现代化才能满足新药开发的需要，为确保中药使用安全、有效，对各种药材进行准确地鉴定显得十分重要。传统的鉴定方法有:基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定。然而，这些鉴定方法均为生物体遗传表现性的鉴别，它们不仅受到遗传因素的影响，而且与生长发育阶段、环境条件、人类活动( 如引种驯化、加工炮制等) 有着密切关系，具有很大的变异性和可塑性。随着现代分子生物学技术的迅猛发展，分子生物学和基因工程技术日臻成熟，用DNA 分子遗传标记技术对中药材进行鉴定具有不受环境因素、个体发育阶段及组织部位的影响，多态性强，准确率高等特点，展示了良好的应用前景[2]。DNA分子遗传标记(DNA Molecular Genetic Marker)技术在基因定位、品种鉴定、资源评价、物种亲缘关系和系统演化等个方面取得了很大进展。现从几个方面探讨它们在药用植物研究上的应用。 1.DNA 分子遗传标记技术 DNA分子遗传标记技术( 也称DNA分子遗传诊断技术)是指通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术。任何生物种或个体都具有特定的DNA 多态性，通过直接诊断分析DNA的多态性，便能避开遗传特性表现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰，快速准确地鉴定药材真伪[3]。 1.1 Southern 杂交为基础的DNA分子标记技术 限制性内切酶切片断长度多态性( Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP)，单链构象多态性RFLP (Single Strand Conformation Polymorphism-RFLP,SSCP-RFLP)等。这一类技术的共同点是利用一种或几种限制性内切酶消化不同生物个体的DNA分子，再通过特异性的克隆或合成的探针进行分子杂交来揭示其DNA 的多态性。 1.2 PCR 为基础的分子标记技术 随机扩增多态性DNA(Random Amplifed Polymorphi cDNA ,RAPD)，标记位点测序( Sequence Tagged Site ,STS )，随机引物PCR( Random Primer-Polymerase Chain Reaction ,RP-PCR)，任意引物PCR(Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR) ;寡聚苷酸引物PCR (Oligo Primer-PCR,OP- PCR) 等。这一类技术的共同特点是利用合成的随机引物(常为5~10个或更多个寡聚核苷酸)，通过PCR扩增不同生物个体的DNA分子，然后直接进行电泳分析来揭示其DNA的多态性。 1.3 重复序列为基础的DNA分子标记技术 卫星DNA(Satellite重复序列为几百~几千个碱基对)，微卫星DNA (Microsatellite，重复序列单位为2~5个碱基对)，小卫星DNA(Minisatellite，重复单位为大于5 个碱基对) 等。 1.4 mRNA为基础的分子标记技术 差异显示( Differential Display ,DD)，逆转录PCR(Revert Transcription PCR,RT-PCR)差异显示逆转录PCR (Differential Display Revert Transcription PCR,DDRT-PCR)等[4]。 2.DNA分子遗传标记鉴别的依据 生药鉴定研究首先要找到具有物种特异性的遗传标记(genetic marker)，这种遗传标记主要有形态、组织细胞、化学成分、蛋白质、染色体组型、血清学、同功酶等特征[5]。然而有些特征为生物体的遗传性和环境因素共同作用的结果，它们受到遗传因素影响的同时，还与生物体的发育阶段及环境条件对生物体的作用有着密切关系。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此，用DNA分子特征作为遗传标记-即DNA分子遗传标记(DNA molecular genetic marker)进行物种鉴别更加准确可靠。 DNA分子是由A,T,C,G4种碱基构成双螺旋结构的长链状分子，遗传信息便