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法医几种常用DNA提取方法及比较 一 Chelex100法 ： 方法： 评述： Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的，而目前mtDNA扩增一般用普通Taq酶，所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时，尽量去除干净血红素，显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发，用毛根进行STR检验时，纯水清洗也非常重要，如果没有清洗干净，毛根DNA本身很少，很易检出为混合型。因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振荡洗涤，不离心，多换水。 清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。　检材参考加入量 0.5×0.5cm血斑 150ul-200ul 二步法精斑 100ul 毛根 10ul 烟头 30-50ul 对于组织，难溶检材，有疑问检材，均可加入终浓度为100ug/ml左右PK，有时间隔一段时间，补加适量PK，PK 蛋白水解酶K 作用最佳pH为8.0。 5、加入Chelex100后，56℃浸泡时间，血斑≥15min;组织≥30min，二步法精斑≥1h。 6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入Chelex100，因为Chelex100为PCR抑制剂。 7、Chelex100使用浓度5%，有些人用10%，有些人用20%，各人爱好。配制好5%Chelex100 pH应在10—11之间，否则应丢弃，不应人为调整Chelex100悬液pH值。 二 有机法 原理： 方法：剪取适量检材，置于0.5ml离心管内，清洗方法同用Chelex100法提取DNA，加入适量纯水及终浓度为100μg/ml PK，37-56℃孵育15min至数10小时，有时间隔一段时间补加适量PK 13,000rpm 5min　　吸上清于另一管　加入等体积平衡酚　　振荡或颠倒彻底混匀　　13,000rpm 5min　吸上清水相于另一管加入等体积1：1混合平衡酚：氯仿　　振荡或颠倒彻底混匀　　13,000rpm 5min　　吸上清水相于另一管　加入等体积氯仿　　振荡或颠倒彻底混匀　　13,000rpm 5min　　吸上清水相于另一管　加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上　13000rpm 5-10min　　弃上清　　室温凉干或1005min烤干　　加入10-20μl纯水　　室温溶解或1005min帮助溶解　　离心上清备用 ： 1有机法是经典DNA提取方法，目前国内外仍大量采用，其提取DNA特点为双链，纯度高。 2有机法缺点是应用有毒有机试剂，对人体有害，污染环境；多次换管，容易引起检材污染及编号混乱。有机法提取DNA的另一个缺点是不能去除某些染料，血红素等，而这些恰好是PCR抑制剂。 原理：65℃解离后，DNA释放于洗脱液中。 方法：5%Chelex100提取DNA上清液或者用裂解直接提取骨骼、指甲毛发DNA上清液等约移于0.5ml离心管内　→　加入100ul，磁珠5ul →　振荡混匀，室温5min　→　在磁架上吸弃上清　→　加入I 300ul → 振荡混匀　→　在磁架上吸弃上清　→　加入II 300ul→　振荡混匀　→　在磁架上吸弃上清　→　加入II 300ul　→　室温放置2 min干燥　→　加入30-50μl ，振荡混匀　→　6510min　→　速于磁架上吸上清于另一新离心管，备用。 ： 1磁珠法优点是、快速，不有机溶剂，安全无毒。过笔者验证，磁珠法灵敏度，放置月余的毛囊的毛发中成功提取到后期的检测中成功检测到位点。磁珠法用于微量及疑难。 2磁珠法与比较，前者简单、方便，转移离心管次数较少，不易污染，而后者则正好相反。 目前磁珠法被广泛地用于法医，国内的品牌主要有洛阳纳米科技有限公司的法医样本，品牌的磁珠稳定性、灵敏性居于世界前列，与国外某些品牌相比和纯化效果也毫不逊色。 1988年Miller等报导经典盐析法提取血液DNA，其方法为溶解红细胞后，离心沉渣用PK消化，用大约6M饱和NaCl沉淀蛋白质，离心上清中DNA用无水乙醇沉淀，用TE溶解 五 NaOH法 ：强碱溶解、变性蛋白质，破坏细胞膜及核膜，变性核酸酶，释放DNA，NaOH不破坏DNA一级结构。 ： 1、试剂配制　裂解buffer 0.2M NaOH　中和buff