质粒DNA的转化实验原理仪器试剂和操作步骤.docVIP

质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤 【原理】 转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。 本实验采用 CaCl2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于 0 ～4 ℃， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 α扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。 【试剂与器材】 1 ． LB 液体培养基 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。 2 ． LB 固体培养基 LB 液体培养基中加 1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。 3 ． 0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。 4 ．氨苄青霉素 用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml 溶液，置 -20 ℃保存。 5 ．人 Bcl-2 重组质粒 它是 Eco R Ⅰ单酶切的 pBluescript Ⅱ KS - 载体与 EcoR Ⅰ单酶切的人 Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为 4 861bp ，前者是一种由 pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。因此用 Eco R Ⅰ酶切则应到空载 pBluescript Ⅱ KS - 载体 2.96kb 和人 Bcl-2 cDNA 片段 1.9kb 。配制成 2g/1 μ l 。 6 ．大肠杆菌 DH5 α 此为 DNA 扩增菌 7 ．恒温水浴箱 8 ．超净工作台 9 ．高速冷冻离心机 10 ．恒温摇床 11 ．恒温箱 12 ．消毒离心管 13 ．消毒 tips 14 ．玻璃培养皿 直径 90mm 15 ．玻璃涂布器 16 ． 95% 乙醇 17 ．标记笔 【操作步骤】 1 ．细菌感受态细胞的制备 将 DH5 α菌种划线于 LB 琼脂板上， 37 ℃培养过夜。挑取单菌落接种于 5ml LB 培养基中， 37 ℃振荡培养培养过夜。次日取菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培养基的烧瓶中， 37 ℃剧烈振荡培养至约 2 ～ 3h ，待 A 600 值达到 0.3 ～ 0.4 时将烧瓶置于冰浴 10 ～ 15min 。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的 50ml 离心管中。 4 000 × g ， 4 ℃离心 10min ，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/L CaCl2 重悬菌体，置冰浴 30min 。 4 000 × g ， 4 ℃离心 10min ，弃培养基。再加 4ml 预冷的 0.1mol/L CaCl2 ，轻轻重悬菌体，置 4 ℃冰箱 12 ～ 16h 。 2 ． DNA 重组子的转化大肠杆菌 DH5 α 本实验中的 DNA 重组子为人 Bcl-2 重组质粒。在无菌条件下按每管取 200 μ l 新鲜感受态 DH5 α细菌置于无菌的 5ml 塑料离心管中，共 2 管，分别加入人 Bcl-2 重组质粒 10ng 和消毒水 作阴性对照 各 5 μ l ，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min 。 42 ℃，热休克 90s ，中途不要摇动离心管，每管加 800 μ l 无抗生素的 LB 培养基，于 37 ℃空气摇床中以 150 r/min 速度振摇 45min ，使细菌复苏。每管取 200 μ l 加至含氨苄青霉素（ Amp ）的 LB 琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置 20min ，使液体吸收，然后 37 ℃倒置培养 12 ～ 16h 至单菌落形成。 【 注意事项 】 1 ．含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α菌落平板倒置置于 4 ℃保存，于