培训课件-荧光原位杂交.ppt

荧光原位杂交 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料. 荧光原位杂交 FISH的原理 FISH的操作及应用 FISH的展望 FISH的原理 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。 荧光原位杂交 原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误 差等。 与之比FISH的优点 ①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 ②方法敏感,能迅速得到结果 ③在同一标本上,可同时检测几种不同探针. ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 荧光原位杂交 FISH技术包括下列几个步骤： 1）探针的制备和标记 2）探针及标本变性 3）杂交 4）洗脱 5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） 6）封片 7）荧光显微镜观察FISH结果 荧光原位杂交 探针的制备和标记 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。其长度介于15至数千个核苷酸之间，但以250~650个核苷酸杂交效果最好 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。 直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 荧光原位杂交 单拷贝探针： （1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。 荧光原位杂交 单拷贝探针 DNA片段的染色体定位 荧光原位杂交 单拷贝探针 FISH检测微小缺失 荧光原位杂交 单拷贝探针 FISH检测微小缺失 荧光原位杂交 染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1) 荧光原位杂交 简单重复序列探针 简单重复序列探针(simple repetitive probes)——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes) 其靶序列为α卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。特点：信号强应用：(a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断 荧光原位杂交 简单重复序列探针 荧光原位杂交 染色体的着丝粒 异染色质区域 简单重复序列探针 间期细胞遗传学的意义：细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相，间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。 荧光原位杂交 染色体涂染探针 染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针探针来源：（1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent)体细胞杂种组织融合的产物；（2）荧光激活的流式细胞仪(fl