果蝇Mef2基因多克隆抗体的制备及检测.docVIP

果蝇Mef2基因多克隆抗体的制备及检测 摘　要　为了在果蝇模型中进一步研究Mef2基因的功能，制备了Mef2多克隆抗体．以果蝇cDNA文库为模板，PCR扩增出亲水性和特异性均好的果蝇Mef2基因片段，将其克隆入pET28a原核表达载体，然后将重组质粒转化入大肠杆菌菌株Rossetea，用IPTG诱导表达融合蛋白．融合蛋白先经NiIDA凝胶柱纯化，再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，然后用不同浓度的抗体分别进行Westernblot实验检测抗体效价．所得结果显示获得了较高效价的果蝇Mef2多克隆抗体． 关键词　Mef2；原核表达；多克隆抗体 中图分类号　R39211 文献标识码　A 文章编号2012）0座机电话号码 Mef2属于MADS家族转录因子基因，MADS家族是指其蛋白质结构域含有高度保守的MADS结构域的一类转录因子的总称［1］．MADS结构域是一种DNA结合结构域，由55～63个氨基酸组成，所识别并结合的DNA保守序列为CArG框［CC（A/T）6GG］． Mef2位于果蝇2号染色体上，mRNA全长5　990　bp，编码501个氨基酸．脊椎动物有4种MEF2蛋白（MEF2AD），而果蝇中只有1种MEF2蛋白（DMEF2）［2］．不管是脊椎动物还是果蝇中的MEF2蛋白都含有一个高度保守的MADS和MEF2结构域，并且由它们来介导DNA结合、二聚作用、蛋白质蛋白质的相互作用［3］． Mef2最初是在分化的肌肉细胞中作为一个肌肉特异结合的活性因子被鉴定的，1997　年却发现Mef2基因在心脏发育的过程中起重要作用［4］．在果蝇中，Mef2首先在原肠胚形成时在整个中胚层中表达，随着胚胎的发育，它的表达逐渐限制在体节、内脏和心肌细胞中［56］．鉴于Mef2基因在果蝇心脏发育的过程中起着重要的作用［7］，所以制备一个特异性好的多克隆抗体尤其重要，对进一步以果蝇为模型研究Mef2基因具有重要的意义． 1.1　实验材料和试剂 大肠杆菌Rosseta菌种，pET28a菌种以及coli　DH5α菌种为本实验室提供；限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，DNA、蛋白质相对分子质量Marker，Tag　DNA聚合酶购自深圳晶美公司；pMD18T载体和连接酶购自大连TaKaRa公司；UNIQ10柱式DNA　胶回收纯化试剂盒购自上海生工公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；Glutathione　SepharoseTM　4B蛋白纯化试剂盒购自PIERCE公司；弗氏佐剂购自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、IPTG（异丙基βD硫代半乳糖苷）等购自上海Sangon公司；新西兰大白兔购自中南大学实验动物学部． 1.2　引物设计与合成 从NCBI数据库（http：//）检索出果蝇Mef2基因的序列，根据巢式PCR的原理利用Primer　Premier　5．0　软件设计两对引物：第一对：DMef2S1：5′CGCCAGCTGCCGGAAATCCA　3′；DMef2A1：5′GCGTCTGCAGCGTGACCACT　3′．第二对（分别加入EcoR　Ⅰ和Xho　Ⅰ酶切位点）：DMef2S2：5′GAGAATTCATGGGCCGCAAA　AAAATTCA　3′　EcoR　Ⅰ；DMef2A2：5′GGCTCGAGGTGGACTGGCCTGCAGCAGG　3′　Xho　Ⅰ． 1.3　基因克隆和载体构建 选取30只野生型果蝇，液氮冷冻30　min，用Trizol法提取总RNA［8］，反转录PCR扩增，获得firstchain　cDNA．然后以firstchain　cDNA为模板用第一对引物进行PCR扩增，然后以所得产物为模板，用第二对引物进行PCR扩增，得到目的片段［9］．目的片段经纯化后克隆入T载体，转化入DH5α感受态细胞中，酶切检测筛选出阳性单克隆，经测序鉴定后将DNA片段从pMD18TMef2质粒上切下，连入pET28a载体（EcoRⅠ和XhoⅠ酶切线性化），得到阳性克隆，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，得到重组表达质粒pET28aMef2． 1.4　Mef2融合蛋白诱导表达及纯化 pET28aMef2重组表达质粒转化入大肠杆菌菌株Rosseta，筛选出阳性菌落，然后接种于LB　培养基（含100　mg/L　氯霉素，卡那霉素）37　℃　培养12　h左右，以1∶　50转接扩大培养至OD600达0.6，按0.1　mol/L　加IPTG，25　℃诱导，4、5、6、7　h各取1　mL菌液，确定最佳诱导时间． 收集诱导后大肠杆菌，PBS漂洗后超声裂解，离心取上清．4　℃下与经Binding　Buffer漂洗活化后的NiIDA凝胶柱结合，Washing　Buffer洗去杂蛋白，Elution　Buffer洗脱目的蛋白，获得纯化的HisMef2融合