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Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR 选择一个恰当的方式：RNAi，TALEN,CRISPR 摘要：研究基因功能最常见的方法是减少或阻断基因的正常表达。十多年来，RNAi一直是这一领域的王者，它提供了一个奇妙的方法来阻断许多生物的基因的表达。然而随着新技术的涌现（尤其是CRISPR技术），正逐渐瓦解RNAi在哺乳动物细胞研究中的统治地位。日新月异的技术发展也给研究者们带来了一个问题，“到底应该在实验中选择那一种技术呢？” 这篇文章就是通过比较和对比这些技术而形成的一篇指导性文章。 引言： 人类基因组计划测序的成功(Lander et al., 2001) ，给人们提供了关于人类的基本内在作用方式的全新的深入了解，也使得人们向治愈大多数疾病迈进了一大步。在其完成了的15年多后，生物学家仍在继续致力于把攻坚于大量的基因组序列编码的成千上万的未知功能的基因 (Birney et al., 2007)。基因组测序是一个惊人的挑战，但是，具有广大的前景，而且只是最初的一小步。最困难的挑战摆在面前：破译3.3亿DNA碱基对隐藏的意义，通过设定成千上万的基因的功能来说明它们是怎样一起作用使我们之所以成为人类的。这是一个伟大的生物学承诺，但还尚未实现，随着最近新的生物学技术的发展，最大的发现还在后面。 破译基因功能的金标准就是阻断正常的基因表达和研究其产生的表型。这种功能失活实验从Thomas Morgan发现了基因位于染色体上而且携带导致变异表型的突变基因开始，已经运用了100多年，在此基础上，数代科学家们致力于用基因突变、化学物质、放射线和病毒整合来映射每一个表型到相应的特异突变基因。这种正向遗传学方法已经被运用了数十年，由于技术上充满了许多挑战（技术上的限制），使得这个过程（试图随机映射和在基因组DNA海洋里的表面上微小病变都）复杂化了。人类基因组的测序提供了一张图，通过这张图，基因的功能可以被破译，但是它缺少方法来有选择地阻断特异基因以非随机的方式。 RNAi 是被Fire and Mello发现的，它提供了靶向作用一个基因的神奇的突破口，使得研究者（通过反向遗传学）了解了DNA序列。这项发现的时间是最好不过的了，而且在人类基因组序列可以免费获取之后，它作为一种方法很快就发表了。 Fire and Mello的工作震惊了科学界，他们展示了一个双链RNA简单的注射进入C.线虫（秀丽新小杆线虫），可以强有力地沉默任一基因序列而且产生相应的表型来揭示基因的功能(Fire et al., 1998)。当RNAi的作用机制被发表以后，它很快就被应用到人类细胞中来抑制特异的基因 (Elbashir et al.,2001)。它使用的便易使得RNAi这种方法成为了人们破译基因功能的一个选择。然而，RNAi也会产生亚等位基因表型，这种表型并不能反映完全的基因失活，这可能出现在基因突变中。这个和其他实验鼓励了科学家对于反向遗传学的新的技术的探索。 随着锌指核酸酶（ZFNs）和随后的转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）的发现(Gaj et al., 2013)，功能完全失活的反向遗传学方式变成了可能。这种方法利用定制DNA结合结构域（DBDs），（DBDs被设计用来识别特异的靶向DNA序列），和核酸酶融合，DBDs可以用来引入DNA双链断裂（DSBs）和序列框移突变到基因中，这可以导致它们的敲除 (Sung et al., 2013)。 一个最新的和难以置信的强有力的新增的基因组编辑方法就是CRISPR/Cas系统。它涉及了细菌对抗病毒感染（传染）（是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御），最初是在嗜热链球菌中被提及的(Barrangou et al., 2007)。最近，从化脓链球菌中提取的II型CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用于CRISPR系统中而且成功编辑了人类基因组 (Cho et al., 2013; Cong et al., 2013; Jinek et al., 2013; Mali et al., 2013c)。CRISPR/Cas系统的整个发现和发展的历程在以前已经得到了极好的描述 (Doudna and Charpentier,2014)。总而言之，这些有力的方法为迅速有效地破译基因的功能提供了一个新的可能。 随着不断增加的关于基因失活实验的分子方法的发现，许多研究者就出现了关于选择一个最佳方法的问题。本篇综述就是基于通过比较和对比这些奇异的新的方法的总结（表一Table 1），而且给研究者提供了一个“实验指导”来决定怎样来揭示细胞中的基因的功能。你应该选择哪一个呢？ 正文： RNAi RNAi是