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高效液相色谱仪知识讲座 Leo.xu 一、简介 HPLC（High Perfomance Liquid Chromatography）是20世纪60年代末在经典液相色谱法（液相色谱法）上发展起来的一门新的分析方法。 分类：根据用途分为分析型与制备型。根据流动相（M.P.）与固定相（S.）的极性大小分为正相色谱法（ M.P. S. ）和反相色谱法（ M.P. S. ）。 二、专用术语 色谱图（chromatogram）：色谱分离后的各组分进入检测器后，检测器给出的信号随时间变化的曲线自然数为色谱流出曲线，亦称为色谱图。 基线：实验条件下，柱后没有组分通过检测器时所得到的信号-时间曲线称为基线，通常为一水平直线。 峰面积（A）：是色谱峰与基线围成的面积，是定量的分析的主要依据。 保留时间（tR）：指被测组分从进样开始到该组分色谱峰顶所对应的时间。 分配系数（K）：当组分从柱头加入，流动相就携带组分向前移动，在固定相和流动相之前进行分配。在一定温度下，当分配体系达到平衡时，组分在两相中的浓度之比为一常数。这一常数称为分配系数。 噪音：由于各种偶然因素，如固定液挥发、外界电信号干扰等引起基线起伏的现象称为噪音。 分离度（R）：两色谱峰峰尖距离与峰宽均值的比值为分离度。中国药典2005年版规定R应不低于1.5。 拖尾因子：反映整个色谱条件的一个参数，中国药典规定拖尾因子应在0.95-1.05之间。 理论塔板数（n）：用于评价柱效的一个参数。理论塔板数越高，柱效越好。 三、液相色谱仪的组成 储液器 泵 进样器：进样阀或注射器 色谱柱：内有固定相以分离混合组分的柱 检测器：能检测色谱柱流出组分及其量的变化的器件 记录仪 四、泵的要求 输出压力高：一般至少要有15~35MPa,最高有50MPa。 流量范围大：分析型在0.1~10mL/min内连续调节，制备型要求在100mL以上。 流量恒定：要求无脉冲，精度重复性在0.5%左右。 耐腐蚀：能适合各种有机溶剂、水和缓冲溶液。 适于梯度洗脱。 目前最常用的是柱塞往复泵。 其他：密封、小巧、便于清洗和维护等。 五、检测器 要求：具有高灵敏度、噪音低、线性范围宽、重复性好、适用性广等性能。 原理：通过检测器的组分，对特定波长紫外线的吸收服从 Lamber-Beer 定律（A=ELc）。 高效液相色谱法常用的检测器有紫外检测器（UVD）、光电二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FD）、示差检测器（RID）、蒸发光散射检测器（ELSD）等。 （一）紫外检测器（ Ultraviolet Visible Detector,UVD ） 光源一般为氘灯（D2） 温度和流量的变化比较不敏感 对许多样品有很高的灵敏度 检测下限低(可达3×10-9g) VWD光路 （二）光电二极管阵列检测器（Photodiode Array Detector,DAD） 可作紫外一可见光谱的快速扫描检测，使液相色谱所能提供的信息量大幅度增加。 可获得“在流”色谱的全部光谱的全部信息，即不必停留，可跟随色谱峰发描，用于观察色谱柱流出组分的每个瞬间的动态光谱吸收图。 所获得的图为三维光谱-色谱图（3D- spectro-chromatogram,简称三维图）。图上t、A、λ分别对应x、y、z 轴。 DAD效果图 （三）荧光检测器 (Fluorescence Detector,FD) 荧光检测器是测量溶质受紫外光辐照激发出的荧光能量。 要求：流动相必须不吸收在原始波长或荧光波长处的辐射。 对于具有强烈发射荧光能力的化合物，灵敏度能高达10-9克/毫升。 如：某些代谢物、药物、氨基酸、胺类、维生素和甾族化合物都可用荧光检测器来检测。 FD光路图 （四）示差折光检测器（Refractive Index Detector，RID） 分为反射式RID和偏转式RID 对流量的变化，特别是在升高温度时，是很敏感的。 灵敏度取决于样品和流动相之间的折射率之差。 不能采用梯度洗脱模式进行检测。 检测灵敏度低，较UVD低1000倍。 反射式RID 偏转式RID （五）蒸发光散射检测器（ Evaporative Light Scattering Detector，ELSD ） 原理：将色谱柱流出液引入雾化器，与通入的气体（常为高纯氮，有时是空气）混合形成均匀的微小液滴，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相，而样品组分形成气溶胶，然后进入检测室，检测器检测得到信号。 用途：用于检测糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等。 要求：流动相必须是挥发性的，不可含有缓冲盐类。 缺点：灵敏度低，尤其是有紫外吸收的组分。 蒸发光散射检测器 六、色谱分析的心脏-色谱柱 要求：分离度高、柱容量大及分析速度快等。 结构：采