04章核苷酸和核酸4详解.ppt

目前已完成的完整个人基因组图谱 不同生物体中DNA的大小 原位杂交技术证明卫星DNA位于染色体的着丝点和端粒处  中度重复序列（moderately repeated sequence）：150-300bp ，重复千余次 ，20% 一般不编码蛋白质，功能可能类似于高度重复顺序。 有些为编码蛋白质（组蛋白基因，免疫球蛋白基因）或RNA （rRNA，tRNA）的结构基因 大部分真核生物，包括人类，有大于100个拷贝的rRNA基因 单一序列（unique sequence）/低度重复顺序 在单倍体基因组中只出现一次或数次，占哺乳类基因组50~80%，人基因组中约65%。序列长750~2000bp，相当于一个结构基因的长度。 单拷贝顺序中只有一小部分编码蛋白质，其它部份的功能尚不清楚。 在基因组中，单拷贝顺序一般与重复序列相间排列。 意义 细胞内DNA都是以超螺旋形式存在的，超螺旋是DNA三级结构的重要特征。 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。 大多数细胞内DNA处于欠旋状态 闭环DNA（closed-circular DNA ）分子接近B型结构时（10.5bp/圈）为松弛状态。 生物学来源的闭环DNA通常为非松弛状态。 细胞调节的张力诱导DNA超螺旋 闭环DNA通常处于欠旋状态 欠旋有利于维持十字形结构、形成Z-DNA 大肠杆菌拓扑异构酶II（DNA促旋酶）的作用 酶结合于DNA→DNA分子中2区域在结合复合体中以特定构象重叠——正结节、负结节→一片段双链断裂， 另一片段穿过断口→2负结节 拓扑异构酶催化的连系数变化 图中所有DNA具有相同碱基数，但超螺旋程度不同。 串珠状核小体电子显微镜图 1974年Kornberg——核小体是所有真核生物染色体的基本结构单位 。 核小体的组成 小球菌核酸酶处理染色质→单个的核小体颗粒。(核酸内切酶剪切颗粒之间 “裸露”的DNA) 对染色质进行部分酶解处理，产生一系列不同长度的DNA片段，片段间有一个共同的“阶差”，——等于单个核小体的DNA片段大小（200nbp左右)。 真核生物染色体组蛋白 小球菌核酸酶处理核小体单体，随时间延长，降解产物(DNA片段)渐短，从200bp降至146bp，难再降解。这种稳定结构为核心颗粒，由146bp的DNA片段及H2A、H2B、H3和H4各2分子组成。 降解至160bp，提取物中H1丢失——H1位于“裸”DNA与核心颗粒毗邻， “裸”的DNA长60bp左右，称连接区DNA。 连接区DNA的长度在不同物种差异较大，其范围在10~140bp。 核小体是由直径2nm的DNA双螺旋链绕组蛋白形成直径11nm的核小体“串珠”结构 以每碱基对沿螺旋中轴上升距离为0.34nm计，200bp DNA的伸展长度为68nm，形成核小体后仅为11nm，长度压缩了6~7倍 螺线管的形成使DNA一级包装又压缩了6倍 每个螺线管包含408nm(6×68nm)长度的DNA链，每圈螺线管的长度几乎等于核小体直径，即11nm，故染色体的二级包装相当于将DNA长度压缩了近40倍。 3.三级包装——染色质纤维环(突环，loops of chromatin fiber) 螺线管纤维缠绕在非组蛋白构成的中心轴骨架（支架蛋白质）上形成染色质纤维环。 4.玫瑰花结→染色体 第十二节核酸的分离纯化和鉴定 一、核酸的分离、提取通则 防止核酸的降解和变性 : 防止过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏（一般在 pH 4-10下进行） ; 避免剧烈搅拌； 防止核酸酶（DNase , RNase ）的作用。 抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。 抑制RNase： 实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑 制剂。 二、DNA的提取 改变盐浓度提取：1mol / L NaCl溶解DNP, 0.14mol/LNaCl 沉淀DNP, 酚振荡抽提去除蛋白质，沉淀DNA（乙醇、异丙醇） 蛋白酶K和SDS消化后，酚抽提去除蛋白质，沉淀DNA（乙醇、异丙醇） 氯化铯密度梯度离心纯化 真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，可利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。 分离沉淀DNA 三、RNA的提取 RNA不稳定，同时R