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RT―PCR检测手足口病病原体结果分析 　　摘要：目的：应用分子生物学技术RT-PCR检测手足口病病原体EV71和CoxA16，为手足口病的治疗和预防提供可靠的依据。 　　方法：收集2010年7月至2012年6月期间我院收治的手足口病患儿咽拭子、大便标本各110份，疱疹液标本98份，应用RT-PCR技术对病原体EV71和CoxA16监测分析。 　　结果：110例患者均检出EV71病毒，阳性率100.0%；咽拭子、大便及疱疹液标本中EV71检出率分别为96.4%、92.7%和100.0%。CoxA16的检出率分别为：咽拭子16.4%、大便19.1%、疱疹液19.4%；不同标本对于EV71和CoxA16的检出率无显著性差异（P0.05；P0.05）。 　　结论：RT-PCR检测手足口病毒时间短、敏感性高、特异性高，可作为临床诊断手足口病的有效依据。 　　关键词：手足口病 EV71 CoxA16 RT-PCR 　　【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）04-0366-02 　　手足口病（Hand-foot-mouth disease）是世界范围流行的儿童常见疾病，由肠道病毒（Enter virus 71，EV71）和科萨奇病毒（Cox saekievirus A，CoxA16）感染最为常见。以往临床上对于HFMD的诊断主要借助于细胞分离病毒或特异性血清中和等实验结果，然而这两种检测方法均需要1～2周，很容易延误病情。本文采用RT-PCR检测技术对110例患儿分泌物中EV71和CoxA16进行检测，报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 研究资料。2010年7月至2012年6月我院隔离病房110例手足口患儿，均符合卫生部《手足口病预防指南》诊断标准。其中男25例，女85例，年龄2个月至12岁，平均年龄（2.5±1.8）岁。患者均以突然发热或持续性高热不退前来就诊，手、足部及口腔出现皮疹98例。就诊时，患者出现乏力、疲倦，部分患者出现抽搐、肢体抖动等症状；49例患儿实验室检查显示外周白细胞计数不同程度增高；19例X线显示肺部纹理增多。 　　1.2 仪器与试剂。RT-PCR检测仪器采用罗氏480；采用上海之江生物科技有限公司提供的EV71和CoxA16检测试剂盒对标本RNA进行RT-PCR检测，具体操作遵循试剂盒说明书进行。 　　1.3 检测方法。 　　1.3.1 标本的收集。采集患儿咽拭子、大便各110份，疱疹液标本98份，送至我院中心实验室进行检测。标本后立即存放于-20℃环境保存。 　　1.3.2 病毒RNA提取。取标本2g，加入无菌生理盐水1ml重悬。取100ul标本放置于1.5灭菌离心管内，添加Trizol试剂200ul、氯仿100ul，振荡器强力振荡20秒后静置3min，之后12000rpm离心处理2min。取上层无色液体，注意与中间层絮状物的区分，将液体转移至新灭菌的0.5ml离心管内，加入10ulRNA提取液A充分震荡摇匀，8000rpm离心处理1min，去除管内液体成分，之后加入400Ul75%乙醇振荡摇匀，8000rpm离心处理1min，抽干液体成分，如有剩余液体可采用枪头引流，避免触及沉淀颗粒。将装有沉淀物质的离心管置于60℃烘烤箱内干燥5min，加入30ulDepc处理的消毒蒸馏水，移液器充分重悬，静置1min后8000rmp离心处理1min。 　　1.3.3 RT-PCR反应。罗氏480PCR仪对标本进行PCR扩增，按照说明书进行混合液的配置，调整循环参数，同时设置阳性梯度模板和阴性对照。结果的判定严格遵照罗氏480仪器操作说明书进行。 　　1.4 统计学处理。采用SPSS15.0软件进行数据统计学处理，计量资料采用X2检验。 　　2 结果 　　2.1 EV71和CoxA16检出情况。110例患者均进行EV71和CoxA16病毒检测。EV71检测结果：咽拭子标本110份，检出EV71106份，检出率96.4%；大便标本110份，检出EV71 102份，检出率92.7%；疱疹液标本98份，检出EV7198份，检出率100.0%。 　　CoxA16检测结果：咽拭子标本25份检出CoxA16，检出率22.7%；大便标本16份检出CoxA16，检出率14.5%；疱疹液标本19份检出CoxA16，检出率19.4%。见表1。 　　2.2 重症病例EV71和CoxA16感染情况。本组重症病例35例，均检出肠道病毒EV71，其中18例患者疱疹液标本CoxA16阴性，11例大便标本CoxA16阴性，15例咽拭子标本CoxA16阴性。提示，我院手足口重症患者的病原菌以EV71为主，CoxA16可能与重症感染有关，有待进一步研究。 　　2.3