非那西丁体外温孵实验解决方案.pptVIP

成员： 1.肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度测定方法的建立。 2.熟练操作HPLC。 3.了解肝微粒体。 实验内容 1.建立非那西丁体外温孵实验测定其代谢速率的实验方案。 2.开发大鼠肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚测定的方法，制备对乙酰氨基酚的标准曲线，并采用HPLC法建立标准曲线用于肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度测定。 肝微粒体简介 肝细胞内还含有肝微粒体，是药物代谢及生物转化的重要场所。肝微粒体实质上由内质网碎片和核糖核酸颗粒组成。内含多种与过氧化氢有关的酶系，又称过氧小体，内含胆固醇合成酶系，类固醇，胆红素和药物结合酶系，以及与药物代谢有关的酶系，可使脂溶性药物代谢成水溶性药物，经肾脏排泄。肝微粒体受到损害时，药物代谢发生障碍，药物作用时间延长。 制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法、聚乙二醇法等。 实验过程 一、肝微粒体温孵液的制备。 肝微粒体的制备方法: 1.取大鼠禁食24h,断头处死放尽血液，迅速剖开腹腔取出肝脏，剪碎肝组织，用预冷的Tris缓冲液洗净血污，再用滤纸吸干表面水分后称重，按1:3加入PBS后，加水至1000ml，冰浴，用玻璃匀浆器制成肝匀浆，于4°C，12500r离心20min，取上清液，与88mmol/LCaCl2 混匀，4°C27000离心20min，取沉淀，再用0.1mmol/LTris缓冲液冲洗，4°C27000离心缓冲20min，取沉淀。 实验过程 2.重悬沉淀? 将沉淀物悬浮于含20%甘油的磷酸钾缓冲液中（1g组织加入1ml含20%甘油的磷酸钾缓冲液），反复在冰水浴中吹打均匀，冻存管分装后置-80℃冰箱内保存待用。 3.蛋白定量? 采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。 二、温孵实验。 肝微粒体（0.2mg/mL,80μL），非那西丁溶液（5，7. 5，10，15，20，25，30，40，60，80，100μmol/L ）,100 mmol/L 磷酸钾缓冲（pH7.4）37℃水浴预温孵5min。 加入NADPH体系溶液（10 mmol/L 葡糖－ 6 － 磷酸、1 U·m/L 葡糖－ 6 － 磷酸脱氢酶，4mmol/L氯化镁，启动剂，40μL），在37℃水浴温孵30min后，?加入冰甲醇（终止试剂，100μL），终止温孵。 实验过程 实验过程 （为了考察大鼠微粒体反应中合适的终止试剂，对冰甲醇和冰乙腈的终止效果进行比较分析。发现选用冰乙腈作为终止试剂时，对乙酰氨基酚出峰位置存在干扰，而选用冰甲醇时，无内源性干扰，因此选用冰甲醇作为终止试剂。） 4℃下12000r/min离心15min，取上清液40μL进行HPLC分析。? 实验过程 三、HPLC测定肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度。 色谱条件：Shimadzu Shim － Pack VP －ODS 柱( 150 mm × 4. 6 mm，5 μm) 流速：1.0mL/min 柱温：室温 检测波长：245nm 采用梯度洗脱：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH4.3），B为乙腈。 0 ～ 12 min，A— B( 90∶ 10) ， 12 ～17 min，A— B( 75∶ 25) ， 17 ～ 29 min，A － B( 75∶ 25) ，29 ～ 35 min，A － B( 90∶ 10) ， 35 ～ 40 min，A － B( 90∶10) HPLC 四、建立标准曲线与测定非那西丁体外温孵液代谢速率。 建立对乙酰氨基酚标准曲线 取对乙酰氨基酚储备液，已含有失活微粒体的甲醇水溶液( 1∶ 1) 稀释成0. 2，1，2，5，10，20 μmol/L 的系列标准微粒体样品，分别加入等体积的内标( 10 μmol/L间乙酰氨基酚) ，取20 μL 按照色谱条件进行HPLC 分析，测定对乙酰氨基酚含量。 以对乙酰氨基酚与内标峰面积比值( Y) 为纵坐标，对乙酰氨基酚浓度( X，μmol/L ) 为横坐标，绘制标准曲线。