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山东潮间带刚毛藻DNA条形码鉴定技术 　　摘要 　　DNA条形码在分类鉴定方面较有效的技术。因此，我们将山东潮间带和福建莆田潮间带地区采集的22株刚毛藻目样品在形态分类的基础上采用18S、ITS和LSU三个基因进行鉴定。结果表明，ITS基因是鉴定刚毛藻目形态相似物种的有效分子标记，而LSU和18S基因对属和属以上水平的物种鉴定较为有效。此外，我们通过形态和分子鉴定结合，共鉴定出9个物种，分别是气生硬毛藻、线性硬毛藻、强壮硬毛藻、辽东硬毛藻、短节硬毛藻、扇形刚毛藻、沙生刚毛藻、苍白刚毛藻、小枝刚毛藻、岸生根枝藻。 　　【分类号】：S968.4 　　一 背景介绍 　　刚毛藻目（Cladophorales）是一类种类较多的大型藻，淡水、海水和半咸水中皆有分布。海洋中的刚毛藻目是潮间带中的常见种类，又有固着生长和漂浮生长之分。刚毛藻目归于绿藻门，绿藻纲。该目的特点是藻体丝状，有分枝或不分枝。由多核细胞组成，许多种类细胞壁厚。每个细胞具多数周生盘状或网状叶绿体，淀粉核多数。其生活史为同型世代交替，生殖方式分为有性生殖和无性生殖，有的种类能营养体断裂生殖[1，2]。 　　1915年，Cotton研究了产于威海的气生硬毛藻预示着国内开始研究刚毛藻目。此后，我国海洋生物曾呈奎带领一批学者先后在青岛、海南和厦门发现刚毛藻目海藻总共17种。迟永雪[3]发现了一种中国新种-强壮硬毛藻。栾日孝和栾淑君[4]报道产自大连长海县的7种刚毛藻，分别是沙地刚毛藻、壳生刚毛藻、暗色刚毛藻、罗氏刚毛藻、细丝刚毛藻、美丽刚毛藻和小刚毛藻。在不断的研究中，发现越来越多的刚毛藻新物种。目前我国记录的海产刚毛藻目中有2科6属共58种[5]。 　　由于刚毛藻目形态结构普遍简单，且易受外界环境的影响，变化差异较大，这给依靠形态来鉴定刚毛藻带来了困难。近年来，DNA条形码技术应用越来越多，例如，滕林宏[2]用18S 和ITS两基因鉴定我国刚毛藻目31个物种并对其系统发育学做了研究。Leliaert[6]使用LSU基因来研究代表18个属的37个种，结果表明LSU基因的变异能够有效的解决刚毛藻科分类的难题。 　　二 材料与方法 　　（一） 实验材料 　　自2012年5月到2013年10月，在山东沿海包括青岛、威海、日照，烟台地区采集刚毛藻。2013年5月在福建莆田地区采集样品。总共采集了22株绿藻样品并编号。 　　1 方法 　　取0.1g新鲜藻体放在液氮中充分研磨，用天根植物全基因组提取试剂盒按操作说明的步骤提取全基因组DNA。18S rDNA和ITS引物序列参考藤林宏[2]的通用引物，两个基因PCR反应程序中都为55℃退火。LSU基因的引物参考Leliaert[6]，PCR反应程序中退火温度为53℃。用1%琼脂糖凝胶来检测PCR产物扩增情况，在EB中染色20min，在紫外灯下观察扩增情况并拍照。将扩增成功的PCR产物（30ul）送至生物工程测序公司测序。测序后的正、反向序列用seqman软件拼接形成一条完整且准确的序列。用Clustal X 2.0软件将测得的序列和Genbank 中下载的序列进行多序列比对。用DAMBE软件检测饱和度。用MEGA 5.0 软件构建距离树（NJ 树），bootstrap都为1000。遗传距离采用Kimura双参数距离[7]方法，碱基组成用MEGA5.0计算。 　　三 结果与分析 　　采用三个基因对22株样品进行扩增测序，共得到63条序列。18S序列21条，样品W210没有成功扩增；ITS序列20条，RZ2013331.153和Q210样品扩增不足以达到直接测序标准；LSU序列21条，Q10和Q210样品没有得到序列。通过对各样品的序列相似性及遗传距离的分析，结合系统树上的聚类。得到了最终的鉴定结果（表1）。 　　表1 刚毛藻目样品鉴定结果 　　样品编号 形态鉴定 分子鉴定 采集地点/采集时间 　　RZ2013331.153 气生硬毛藻 线性硬毛藻 日照（前三岛）/ 2013.3.31 　　Q166 线性硬毛藻 气生硬毛藻 青岛（太平角）/2013.4.12 　　Y125 　　Q165 强壮硬毛藻 　　辽东硬毛藻 强壮硬毛藻 　　辽东硬毛藻 烟台（蓬莱）/2012.9.25 　　青岛（太平角）/2013.4.12 　　Q133 线性硬毛藻 气生硬毛藻 青岛（太平角）/2013.1.12 　　Q169 气生硬毛藻 线性硬毛藻 青岛（太平角）/2013.4.12 　　W210 短节硬毛藻 威海（成