PCR技术简介.ppt

PCR出现假阴性原因分析及解决方案 模板因素： （1）模板中含有杂蛋白； （2）模板中含有Taq酶抑制剂； （3）模板中蛋白质残留， 特别是染色体中的组蛋 白残留； （4）提取制备模板时丢失过多； （5）模板核酸变性不彻底。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 模板因素引起假阴性解决方案： 1.配制有效而稳定的消化处理液； 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 酶失活： 1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 酶失活引起假阴性解决方案： 1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶； 2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 引物： 1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 引物引起假阴性解决方案: 1.选定一个好的引物合成单位; 2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度； 3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装； 4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 Mg2+浓度： Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 Mg2+浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应中的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl等），而MgCl2浓度不同（由0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)，由此来摸索最佳Mg2+浓度。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 反应体积的改变： 做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 物理原因： 1.变性温度低，变性时间短； 2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率； 3.延伸时间过短等。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 物理原因引起假阴性解决方案： 1.提高变性温度，延长变性时间，特别是首次循环，必要时可设为95℃ ，10min，或PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 物理原因引起假阴性解决方案： 2.退火温度应根据Tm值来设定，也可首先将退火温度设为45℃ ，然后再逐次提高（以2℃ /次为宜）。 3.延伸温度以1000bp/min足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延伸10min。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 靶序列变异： 靶序列变异导致假阴性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。 解决方案： 根据已知序列重新选择区段设计引物。 二.PCR出现假阳性原因： 1.引物设计不合适； 2.靶序列或扩增产物的交叉污染。 （1）整个基因组或大片段的污染； （2）空气中的小片断核酸污染。 PCR出现假阳性原因分析及解决方案 引物设计不合适： 1.选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的PCR产物。 2.靶序列太短或引物太短导致特异性不强。 解决方案： 选择特异性强的区段设计引物。 PCR出现假阳性原因分析及解决方案 整个基因组或大片段的污染的解决方案： 1.操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染环境。 2.除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离心管及枪头均应一次性使用。 3.必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。 PCR出现假阳性原因分析及解决方案 空气中的小片断核酸污染： 这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出PCR产物，导致假阳性出现。 解决方案： 运用巢式PCR（Nest PCR）来减轻或消除。 三.出现非特异扩增带原因： 1.引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体； 2.Mg2+浓度过高，退火温度过低，PCR循环次数过多； 3.酶的质量不过关，或加Taq酶的量过多。 PCR出现非特异扩增带解决方案 1.必要时重新设计合成引物； 2.减低酶量或调换另一来源的酶； 3.降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数； 4.适当提高退火温度或采