甘蓝与大白菜原生质体融合文献综述.docVIP

甘蓝与大白菜原生质体融合文献综述 甘蓝与大白菜的原生质体融合 文献综述 学院： 生命科学学院 年级： 2011 姓名： 张胜男 前言: 1960年, E . C . C .. k in g 用酶法从高等植物细胞中分离得原生质体, 为高效地从高等植物中分离原生质体打开了局面。随着人们对植物原生质体的研究和了解的深入，植物原生质体融合技术应运而生，原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体技术起源于20世纪60年代，首先应用于微生物的研究，营养缺陷型突变株的原生质体融合，使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术。至今原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且研究领域不断扩大[2]。甘蓝与大白菜是我国主要的蔬菜作物，近几十年对其研究有很大的研究进展。白菜与甘蓝的原生质体融合在理论和实际上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景[3]。 主题： 1.原生质体融合技术 植物原生质体融合技术的整个过程包括：原生质体的制备、原生质体融合，原生质体再生[4] 1.1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 植物原生质体的制备过程中最大的障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的常用方法就是使用酶法，本次实验中去除白菜和甘蓝的细胞壁的酶可选用纤维素酶和果胶酶。影响原生质体制备的因素很多，不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞壁的组成和结构有差异，因此不同的植物有其各自的较为适当的形成条件。渗透压稳定剂如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类(KCL,MgSO4.7H2O)等。质膜稳定剂如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾等增加对质膜的稳定性，酶液的PH值一般在5.4-6.0，植物材料的生理状态如株龄、发育状态、栽培条件等对取材影响很大。本实验可以选用生长约两个月的植株进行。 1.2 原生质体融合过程中的影响因素 1998年举行的中国科协第三届青年学术年会园艺学卫星会议暨中国园艺学会第2届青年学术研讨会上，由杨丽梅 E．Jacobsen M．S．Ramanna M．Bergervoet D J．Huigen 等人发表的论文中提到，原生质体的产量是原生质体融合的关键,该产量在基因型之间及不同融合日期之间是有差异的。愈伤组织及芽的形成能力因不同的融合亲本而异,而幼芽的分化率与愈伤组织的形成能力无关。比较双亲及融合产物的幼叶表皮毛结构是检测融合的一种简易方法,同工酶是一种更精确的检测方法。聚乙二醇在适量钙离子存在下能有效地诱导植物原生质体融合，钙离子主要是通过维持膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。原生质体膜外在蛋白质二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强，这种维持稳定性的效果大小与膜表面分子数量的多少成正比例关系，PEG种类对原生质体融合的影响不大。此外，其融合率还受其他诸因素的影响。影响原生质体融合的因素有很多，特别是环境中的阳离子存在。融合时的pH也对原生质体融合有较明显的影响，一般来讲钙离子，镁离子有助于融合。如有0.01mol/L钙离子存在时，可得到较高的融合率，但在缺乏钙离子时，若ph较低，融合效率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致[5]。 2.原生质体的融合方法 2.1 PEG结合高Ca2+诱导法 聚乙二醇（PEG）是一种多聚化合物，不同种类植物对PEG分子质量的要求不尽相同，实验证明，烟草植物细胞以40%的聚乙二醇融合 的二元融合率最高，PEG与原生质体悬浮液 体积比为3：5，在0.5~0.6mol/L甘露醇为渗透压时，25~30摄氏度融合20~35分钟的融合效果最佳，融合率始终保持在20%左右，甚至可以达到25%[6]。在青菜与芥菜花粉-体细胞原色质体融合研究结果表明，20%~50%的PEG均能诱导融合，且随着浓度的提高异源融合率与一对一融合率不断提高，其中以50%的PEG诱导的异源融合率最高，达51.3%，PEG与10%DMSO配合使用比单独的40%PEG诱导的融合率有较大提高，达51.9%，与50%的PEG效果相近[7]。亲本原生质体制备好后，即可进行融合。关于促融机制，一般认为PEG本身是一种特殊的脱水剂，它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用，进而改变质膜的流动性能，降低原生质膜表面势能，使膜中的镶嵌蛋白质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白颗粒的磷脂双分子层区，在钙离子存在下，引起细胞膜表面的电子分布的改变，从而使接触处的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个原生质体融合。 2.2电