流式细胞仪的原理教案分析.ppt

流式细胞仪的原理及应用 马 黎 明 生命科学与技术学院 流 式 细 胞 术 的 特 点 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 流式细胞仪的基本概念 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 BD FACSCanto流式细胞分析仪 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 …… 一、流式细胞仪的工作原理 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 1.流式细胞仪的基本结构 （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统 （1）液 流 系 统 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 液 流 系 统 示 意 图 （2）光 学 系 统 由激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片和光电倍增管组成。 （3）数 据 处 理 系 统 主要由计算机和及其软件（BD FASCDiva和BD ModFit LTTM）组成。 流 式 细 胞 仪 与 显 微 镜 的 区 别 二、散 射 光 的 测 量 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。 前 向 散 射 光（FS） 前向散射光（forward scatter, FS）： 激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 前 向 散 射 光 示 意 图 侧 向 散 射 光（SS） 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 侧 向 散 射 光 示 意 图 光 散 射 测 量 的 用 途 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 三、荧 光 的 测 量 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 荧 光 染 料 的 特 性 荧 光 信 号 的 检 测 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量 四、细 胞 分 选 原 理 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。 细 胞 分 选 示 意 图 五、数 据 的 显 示 与 分 析 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术 （一）参 数 说 明 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 （二）数 据 显 示 方 式 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 1.单 参 数 直 方 图 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 2.双 参 数 直 方 图 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 （三）设 门 分 析 技 术 1