生化仪器与实验技术在药物质控中的应用教案分析.ppt

电泳样品的处理 1 还原SDS处理 在样品溶液加入SDS，还原剂-巯基乙醇:4-5%,有臭味 DTT:2-3%,无味，不会影响其他样品，100℃ 3-5min, 有时还原剂可能被氧化，冷却后补加，以防蛋白质重新折叠和亚基的缔合，加入EDTA可防止DTT氧化。 2非还原SDS处理 在样品溶液加入1%SDS， 100℃ 3-5min, 二硫键未断裂，不完全去折叠。 3烷基化还原SDS处理 碘乙酰胺：保护巯基不被氧化，多巯基蛋白质测定的分子量略有增加。 蛋白印迹与免疫学测定 应用 原料与制剂中不同蛋白组分的鉴别与定量 方法与原理 将电泳分离的蛋白或多肽转移到固定基质上，以特异性抗体为探针，它与附着于固定基质上靶蛋白或多肽发生特异性反应，对蛋白或多肽电泳图谱上的特定组分进行定性定量分析。 实验步骤 电泳－转移－封闭－免疫检测 特点 将高分辨率的电泳技术与灵敏专一的免疫探测技术结合起来。灵敏度1-5ng，蛋白质或多肽条带不会扩散，操作简便，试剂用量少，便于对蛋白质或多肽进行各种分析。 关于实验上的一些考虑 1.电泳 ： SDS对被分离组分活性的影响 2.固相纸膜： NC膜 －常用0.45um，分子量小于20000时， 用小孔膜，0.1-0.2um。还有尼龙膜