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生化技术思考题 ***生物大分子制备的主要特点？ 与化学产品的分离相比较： 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物，方法的通用性较差。 影响抽提的主要因素有哪些？ PH（碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性物质）； 溶剂的极性和离子强度（极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂）； 水解酶（组织细胞破坏后均会释放水解酶降解生物大分子，故需加入抑制剂或调节提取液的PH等方法使水解酶失去活性）； 温度（温度升高，溶解度加大）； 搅拌（采用温和的搅拌促使提取物的溶解）； 氧化（一般在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止蛋白质中的巯基氧化）； 金属离子； 抽提液与抽提物的比例（一般以5:1为宜）。 ***分离纯化方法主要有哪几类？ 以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。 以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。 以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。 以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。 （1）沉淀法：盐析，有机溶剂沉淀，选择性沉淀；（2）层析技术：吸附层析，疏水层析，离子交换层析，亲和层析，聚焦层析，凝胶层析（3）（4）离心 粗提取液中物质成份十分复杂 欲制备的生物大分子浓度很稀 物理化学性质相近的物质很多 希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质 要求： 要快速、粗放 能较大地缩小体积 分辨力不必太高 负荷能力要大 ***盐析法的优点？盐析的影响因素？ 优点： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。 影响因素（主要与盐析常数Ks有关）： 蛋白质的种类:蛋白质的种类不同，Ks值会有所不同；分子量越大，沉淀所需盐的量越少； 蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀。 蛋白质的初始浓度:0.2%到2%较适宜。 无机盐种类: 阴离子盐析作用顺序：柠檬酸盐PO43－SO42－CH3COO－Cl－ NO3－SCN－ 阳离子盐析作用顺序（一价）：NH4+K+Na＋ 温度:（0℃到4℃）在高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水，使之溶解度下降。在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。 pH值:在接近蛋白质等电点（PI）的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀。需要注意在高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移。 影响带点颗粒在电场中泳动速度的因子有哪些？ （1）颗粒的理化性质：电荷、直径、形状等； （2）电场强度：电场强度越大，带点颗粒的泳动速度越快； （3）溶液性质：PH、离子强度、溶液粘度等； （4）电渗； （5）焦耳热； （6）筛孔：筛孔越大，泳动速度越快； 为什么不连续系统或连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳分辨率高？ 琼脂糖凝胶孔径大，仅对少数蛋白质有筛分效应；而不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，且孔径大小可以调节。 配15%聚丙烯酰胺凝胶溶液10ml，问需要丙烯酰胺和双丙烯酰胺各多少克？ a：b=19:1，所以单体为1.425g，双体为0.075g。 哪些因子影响聚丙烯酰胺凝胶的化学聚合速度？预电泳的目的是什么？预电泳时应注意哪些因素？ 聚合影响因素： 1.大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。低温会减慢聚合反应速度。有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。预电泳：除AP、未聚合丙烯酰胺、杂质注意事项：1.上下电极槽中均加入分离胶缓冲液，预电泳的电流为3mA/管，时间需30分钟～2小时。2.预电泳不能在制好浓缩胶后进行 3.不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。PAGE）、电聚焦、 SDS的一般原理及方法。 琼脂糖凝胶电泳 原理：借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。 1.适合的电泳缓冲液； 2.制备琼脂糖凝胶； 3.加样； 4.电泳的合适电压和温度； 5.染色； 6.凝胶成像. （二）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： 原理： （1）聚丙烯酰胺凝胶合成： 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定 丙烯酰胺的聚合 （2）分离效应：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应 方法 摆好玻璃管 制备分离胶 预电泳：除AP、未聚合丙烯酰胺、杂质 制备浓缩胶 加样：浓缩胶缓冲液+样本+蔗糖/甘油+指示剂 电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流 取胶 固定和谱带检测 迁移率测定 谱带保存 （三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS) 原理：SDS是阴离子表面活性剂，能断裂蛋白质分子内和分子间