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抗体制备过程 SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养 骨髓瘤细胞一般保存在-195℃液氮罐中，实验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，易脱落，因此不需要胰酶处理。但为了防止出现返祖现象，在细胞融合前骨髓瘤细胞株可在15ug/ml8-氮鸟嘌呤的培养基内做适当培养。 融合前7—10天对骨髓瘤细胞进行复苏,步骤如下： 从-80°C 超低温冰箱中取出冻存的 SP2/0 骨髓瘤细胞，立即放入 38°C 水浴，并轻轻摇动使其在 1min 内融化，1000 rpm/min，离心 10min，弃去上清，缓慢加入 1ml10%胎牛血清 IMDM完全培养液并轻吸混匀，转入细胞培养瓶补加培养液至 4ml，置于 37°C，5% CO2培养箱中继续培养。两天后观察细胞的生长情况,更换培养基。一般每两天进行一次传代扩大培养,使细胞处于对数生长期。 融合前 1 天，进行细胞换液并使细胞保持在对数生长阶段。融合当天，将骨髓瘤细胞收集于 50ml 离心管内，1200 rpm，5min，弃去上清；加入 20ml 基础培养液，轻击管底使细胞团分散，1200 rpm，5min，弃去上清；将细胞重悬浮于 10ml10%胎牛血清 IMDM基础培养基中。取 100 ul 悬液，稀释 10 倍后加等体积 0.4%台盼蓝染液进行活细胞计数，细胞活力应大于 95%。计数后,重悬后备用。 阴性血清及饲养细胞的制备 在体外的细胞培养中，细胞的生长依赖于适当的细胞浓度，单个的或数量很少的细胞不易生存或繁殖，必须加入其他活细胞才能促使其生长繁殖，加入的活细胞称为饲养细胞（feeder cell）。饲养细胞能够提高待克隆细胞的密度，使其容易生存与繁殖，还能释放诸如非种属特异性细胞生长因子类的密度，使其容易生长与繁殖[1]。目前常用的饲养细胞为小鼠腹腔巨噬细胞。 材料 = 1 \* GB3 ①Balb/c小鼠 = 2 \* GB3 ②10%FBS-IMDM培养液：IMDM基础培养基+ 10% 胎牛血清 + 1% 双抗 IMDM培养液445ml、胎牛血清50ml、双抗5ml。 = 3 \* GB3 ③HAT选择培养液：IMDM基础培养液+ 2% HAT 浓缩液(50×) + 20% 胎牛血清 + 1%双抗。IMDM基础培养液385ml、2% HAT 浓缩液(50×)10ml、20% 胎牛血清100ml + 1%双抗5ml，过滤除菌，分装保存。 = 4 \* GB3 ④96孔培养板、手术剪、注射器、吸管、血细胞计数板、离心管 （2）操作方法 = 1 \* GB3 ①细胞融合前一天，将未免疫的Balb/c小鼠摘眼球取血，作为抗体检测时的阴性对照。 = 2 \* GB3 ②拉颈处死小鼠，浸泡于75%的酒精中消毒5min-10min，移至无菌操作台中。 = 3 \* GB3 ③用眼科手术剪剪开Balb/c小鼠腹部一小口，揭开皮肤，暴露腹腔。 = 4 \* GB3 ④用注射器吸入5ml基础培养液注入腹腔，反复轻揉小鼠腹部3-5min，然后用该注射器回抽腹腔液体，移入50ml离心管。 = 5 \* GB3 ⑤室温1200r/min，离心8min。 = 6 \* GB3 ⑥弃上清液，轻击管底弹松离心管底部细胞，并用 HAT 培养液重悬细胞，用血细胞计数板计数活细胞，使每毫升约含5.0 x105个活细胞。 = 7 \* GB3 ⑦以1ml吸管将细胞转入96孔细胞培养板中，每孔100ul（约含5.0 x104个细胞），加到 96 孔细胞培养板中，置于 37°C，5% CO2培养箱中培养。 致敏脾细胞（阳性脾细胞）的制备 （1）材料 = 1 \* GB3 ① 免疫过的血清抗体效价高的Balb/c小鼠。 = 2 \* GB3 ②IMDM培养液 = 3 \* GB3 ③10%FBS-IMDM培养液：IMDM基础培养基+ 10% 胎牛血清 + 1% 双抗 IMDM培养液445ml、胎牛血清50ml、双抗5ml。 = 4 \* GB3 ④解剖台板、无菌手术剪、弯头镊子、注射器、离心管、血细胞计数板、倒置显微镜 （2）操作方法 = 1 \* GB3 ①取已经免疫过的Balb/c小鼠，摘眼放血，并分离收集血清作为抗体检测时的阳性对照。 = 2 \* GB3 ②颈脱位致死小鼠。浸泡于70%酒精中5-10min，移入超净台中，固定于无菌解剖板上,掀开左侧腹部皮肤,用无菌手术剪剪开腹膜,无菌条件下取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中,轻轻洗涤,除去脂肪及结缔组织。 = 3 \* GB3 ③将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养棊的平皿中,用Iml注射器在脾脏上扎小孔,再吸上培养基冲洗脾脏,使免疫脾细胞进入平皿中的不完全培养基。反复操作数次。做成脾细胞悬液，用吸