生物化学试验-免疫学.pptVIP

实验器材与试剂： 健康家兔3-5只 完全福氏佐剂 不完全福氏佐剂 γ球蛋白（10-15mg/ml，按照上述方法置备的γ球蛋白），以生理盐水配制 小玻璃瓶 一次性注射器 实验步骤 实验步骤 注意事项 抗原抗体反应 抗原抗体反应 目的要求： 学习并掌握双向免疫扩散的实验原理 掌握双向免疫扩散的实验方法 实验器材与试剂： 生理盐水（0.9%） 琼脂 人血清 兔抗人γ-球蛋白抗血清 载玻片 湿盒 实验步骤 实验步骤 实验步骤 实验步骤 实验结果 注意事项 * * 东北师范大学生物基础实验教学中心 生物化学实验——免疫学 王桂云 目 录 兔抗人γ-球蛋白抗血清的制备 抗血清效价的检测 兔抗人γ-球蛋白抗血清的制备 实验原理： 免疫球蛋白是机体受抗原刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害 。 本实验以人血清γ-球蛋白为抗原免疫家兔，从而制备兔抗人γ-球蛋白抗血清。 兔抗人γ-球蛋白抗血清的制备 目的要求： 掌握制备动物多克隆抗血清的原理 学习并掌握动物多克隆抗血清的制备方法 兔抗人γ-球蛋白抗血清的制备 兔抗人γ-球蛋白抗血清的制备 健康家兔 四足脚掌皮下多点注射（抗原2mg），完全福氏佐剂0.4ml 10天后，背部皮下多点注射（抗原2mg），不完全福氏佐剂0.4ml 10天后，背部皮下多点注射（抗原2mg），不完全福氏佐剂0.4ml 兔抗人γ-球蛋白抗血清的制备 10天后，双向免疫扩散法检测抗血清效价，方法见后 如果抗血清效价低于1：32 继续免疫 如果抗血清效价高于1：32 颈动脉取血收集抗血清 冷冻保存以备用 使抗原与佐剂充分乳化 动物健壮 兔抗人γ-球蛋白抗血清的制备 返回 抗血清效价的检测 免疫双向扩散实验 酶联免疫吸附（ELISA）实验 免疫球蛋白的结构 抗原与抗体的浓度和比例适当 抗原抗体反应 多价抗原：抗原可结合多个抗体分子（半抗原不能形成网状结构） 抗体：必须二价以上（单克隆抗体不能用沉淀法检测） 实验原理： 实验一 免疫双向扩散实验 免疫双向扩散是利用琼脂糖凝胶为介质的一种沉淀反应。 其原理为抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，在二者比例合适的地方，生成肉眼可见的线状沉淀物。 该方法简便，易于观察结果 实验一 免疫双向扩散实验 实验一 免疫双向扩散实验 用生理盐水配制1.5%琼脂糖，微波炉将其加热、融化 实验一 免疫双向扩散实验 冷却至30℃左右，将琼脂糖平铺在载玻片上，厚2-3mm 实验一 免疫双向扩散实验 俯视图 侧面图 打孔 5μl人血清加入中央孔 不同稀释倍数的兔抗人血清5μl加入周围孔 实验一 免疫双向扩散实验 置湿盒中37度过夜 实验一 免疫双向扩散实验 湿盒 恒温箱 效价：抗血清效价为64 实验一 免疫双向扩散实验 铺板后，琼脂凝胶均匀，切忌凸凹不平； 实验一 免疫双向扩散实验 琼脂凝胶温度30℃左右时，铺板。温度过高或过低均不能得到理想凝胶板。 实验二 酶联免疫吸附(ELISA)实验 免疫酶技术是利用抗原与酶标抗体发生免疫反应后，酶与加入的底物发生反应并显色，根据颜色的有无和深浅，经酶标测定仪做定量分析。同样，可以利用酶标抗原检测抗体。 ELISA是在免疫酶技术的基础上发展起来的。利用聚苯乙烯微量反应板吸附抗原或抗体，使其固相化，免疫反应和酶促反应均在其中进行。 灵敏度高、操作简便、没有放射性污染和易于自动化等优点。 实验原理（间接法检测抗体）： 实验二 酶联免疫吸附(ELISA)实验 A 抗原吸附在固相载体表面（酶标板凹孔） B 加抗体，形成抗原抗体复合物 C 加酶标抗抗体 D 加底物，底物降解量=抗体量 A B C D 目的要求： 掌握ELISA的实验原理和方法 实验二 酶联免疫吸附(ELISA)实验 掌握酶标仪的使用方法 实验器材与试剂： 实验二 酶联免疫吸附(ELISA)实验 酶标板 酶标仪 微量取样器 兔抗人γ-球蛋白抗血清 HRP-山羊抗兔抗抗体 正常人血清 过氧化脲 四甲基联苯胺 （TMB） Tween 20、DMSO及其它无机试剂 实验步骤： 实验二 酶联免疫吸附(ELISA)实验 显色 封闭 包被 洗涤 加抗血清 洗涤 加酶标抗抗体 洗涤 终止 酶标仪测OD值 (在450 nm /630nm双波长下) 实验二 酶联免疫吸附(ELISA)实验 酶标仪 注意事项： 显色液要现用现配，避光低温保存 实验二 酶联免疫吸附(ELISA)实验 配制底物显色液A时，加热以促溶解 返回