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第五章 茎尖培养与快速繁殖 第一节 茎尖培养脱毒技术 一、培育无病毒苗的意义 植物病毒病：由病毒和类病毒、支原体等引起，已发现此类病害700多种，无性繁殖植物严重；无特效药，培育无毒种苗是主要防治措施。 获得无病毒种苗的途径： 1）从现有种质中筛选无毒单株； 2）已感染植株脱毒。 二、植物脱毒的方法 1. 热处理：病原物与植物耐热性不同，将植物在较高温度下处理一段时间，病原物钝化、失活或不能繁殖，而植物所受影响较小、生长较快，使病毒减少甚至消灭。 方法： 1) 温汤浸渍：50℃温水中浸10分钟~数小时，简便易行，适用于休眠器官、接穗或种子。 2) 热空气处理：在温热治疗室/箱内，35~40℃，几十分钟~数月。对茎尖效果较好，热处理后取较大茎尖培养，可提高成活率与脱毒率。 注意：易受伤，掌握温度与时间。 2. 茎尖培养脱毒 3. 其他途径脱毒 3.1 愈伤组织培养脱毒：花器官、珠心胚等愈伤中存在无病毒细胞群，从再生植株可得到无病毒苗。 3.2 茎尖微体嫁接脱毒：在无菌条件下，将切取的茎尖嫁接到培养的砧(zhen)木苗上。 3.3 抗病毒剂的应用： 抗病毒醚: 可抑制病毒复制和扩散， 嘌呤和嘧啶类似物; 抗菌素 三、茎尖培养脱毒技术 1、原理 病毒在植物体内分布不均匀，茎尖等生长点因为无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以茎尖几乎不含病毒。 茎尖培养脱毒效果好，后代稳定，目前广泛应用。 2、脱毒技术 2.1 操作 取无菌顶稍1~2 cm→解剖镜(8—40倍)下→剥去幼叶→切取茎尖0.2～0.5 mm、带1~2个叶原基→接种。 注意：随切随接，防止变干；茎尖小较好，但太小不易成活，过大又不能保证完全脱毒。 草莓：茎尖0.2~0.3mm，脱毒率100%；1mm，脱毒率50%。 2.2 培养基 基本培养基: MS、White、 B5等。 碳源: 蔗糖效果好，可用白砂糖 激素：2,4-D、IAA、NAA等，通常低浓度。 2.3 继代培养 初代培养长成的新梢→切成小段→增殖培养基→ 1个月左右→新梢又可扩繁→ →建立和维持茎尖无性系。 继代培养常用MS培养基。 2.4 生根与移栽 常用生根方法： 用1/2、1/3、1/4MS或White培养基，附加NAA、IAA、IBA等，最好加活性炭(0.3％ )。 或者： 将新梢基部浸入50~100mg/L的IBA中4-8h，然后转入无激素培养基中生根。 移栽：同前。 3、脱毒苗的鉴定 3.1 酶联免疫法 （ELISA） 将抗原和抗体的免疫反应与酶的高效催化作用相结合，形成酶标记的免疫复合物；酶遇到底物后生色，用肉眼观察，或用比色法检测结果。灵敏度高，广泛应用。 3.2 抗血清鉴定法 用已知抗血清鉴定未知病毒的种类。 3.3 指示植物法 指示植物：对某种或某几种病毒/类病毒具有敏感反应，并表现明显症状的寄主植物，又称鉴别寄主。 两类指示植物： 一是产生系统性症状，病毒可扩展到非接种部位，常无局部病斑； 二是只产生局部坏死、褪绿或环状斑。 方法：将脱毒苗汁液接种在指示植物上，根据病斑产生与否鉴别脱毒情况。 只能鉴定靠汁液传染的病毒，草本接种较易，木本较难，用嫁接传染法。 3.4 分子生物学检测 1）dsRNA分析 2） 核酸分子杂交。 3） PCR技术。 3.5 电镜检查 4、脱毒苗的保存与利用 4.1 脱毒苗的保存 脱毒植株可能很快被重新感染，应隔离繁殖与保存。 原原种：经脱毒处理、检测无毒的植株； 原种：由原原种在隔离条件下繁殖的种苗； 由原种繁殖的脱毒苗供生产用。 隔离措施：建立隔离带、防虫网室，土壤消毒。 4.2 脱毒苗的利用 尽量用染毒轻的生产场地，一旦感染，应重新采用无病毒苗。 脱毒苗的繁育体系 流程 工作区域 第一年 脱毒试管苗 无菌室 第二年 原原种 无菌室 第三年 原种 网室/温室 第四年 良种 隔离区 第五年 商品种 繁殖区 生产 生产大田 5. 中国组培脱毒苗生产现状 已建立马铃薯（病毒病减产50%以上）、草莓、甘薯、苹果、葡萄、香蕉、菠萝、番木瓜、甘蔗等脱毒苗生产基地。 脱毒苗通常增产20~30%，草莓可达50%，且上等果比例高。 第二节 茎段培养快速繁殖技术 一、