HPLC分离7种糖类物质的方法学研究详解.ppt

LOGO LOGO HPLC分离7种糖类物质的方法学研究 目录： 研究背景 研究内容与目的 色谱条件 结果与讨论 实验结论 致谢 研究背景 由C、H、O元素构成，生物反应重要参与者 糖类 HPLC分离效能高、分析速度快、灵敏度高。因此本实验采用RP-HPLC法分离7糖混合物 常用的衍生化方法有紫外衍生化法（PMP、AEC、SA）、荧光衍生化法（2-AP、2-AA 等 常用的检测方法有化学分析法（比色法、化学滴定法、分光光度法）和仪器分析法（HPLC、HPCE、GC） 研究内容与目的 内容： 选择合适的衍生剂用于糖类物质的衍生化操作，用HPLC法检测 通过色谱条件优化，建立一个多种糖的分析方法 目的： 寻找一种合适的衍生剂，简化衍生操作步骤，优化色谱条件，从而建立一个应用广泛、快速、高效地鉴别糖类物质的分析方法 色谱条件 检测波长：UV 234nm 梯度洗脱： B%：5%-18% （0-25min）→ 18%-18%（25-60min） 流速：1 m l ? m in-1 进样量：2 0 μ L 温度：室温 SinoChrom ODS-BP 色谱柱（250mm×4.6mm，5um） 流动相A： 1 5 m m o l ? L-1磷 酸盐溶液（pH6.2） 流动相B：甲醇 结果与讨论 1、样品进样前处理 实验结果表明，样品经萃取后，除去了大部分剩余衍生剂，但衍生产物损失严重。 综合考虑实验操作的简便性和结果的准确性，本实验选取样品进样前不萃取的处理方法。 萃取步骤对各组分峰面积的影响 2、衍生剂量的优化 结果与讨论 当衍生剂量达到0.5ml后，随着衍生剂量的增加，各成分峰面积呈基本稳定。综合考虑各种因素及经济效益，本实验采用衍生剂的量为0.5ml。 3、缓冲液pH值的优化 结果与讨论 缓冲液pH对各成分间分离度的影响较大，对木糖与衍生剂间的分离影响尤为明显。综合考虑各种因素及色谱柱的耐受范围，并且保证各成分间分离度大于1.5，本实验采用 pH 6.2。 4、缓冲液浓度的优化 结果与讨论 各成分间分离度随缓冲液浓度变化波动较大。综合考虑各种因素及色谱柱的耐受范围，并且保证各成分间分离度大于1.5，本实验采用缓冲液浓度为15 mmol? L-1。 结果与讨论 5、方法的线性范围考察 结果表明，在0.0094～0.3（0.0094、0.0188、0.0375、0.075、0.15、0.3 ）mmol?L-1范围内，各成分糖与其峰面积呈良好的线性关系。 结果与讨论 6、系统的精密度考察 各成分糖的峰面积及RSD% 结果与讨论 6、系统的精密度考察 本实验7糖混合物各成分峰面积RSD%值范围为1.2 %-2.8 %，保留时间RSD%范围为1.2%-1.9 %。可见本实验分析系统重现性良好，能满足分析实验定性及定量要求。 7糖混的保留时间及RSD% LOGO LOGO