2-2免疫组织化学技术课件.pptVIP

第四章、免疫组织化学技术 Immunohistochemistry 吉林大学白求恩医学院 组织胚胎学系 李树蕾 2013-11-19 （二）冰冻切片免疫组化染色 1.恒冷箱切片：新鲜组织或－80℃保存 组织切片10-14um； 2.裱片和晾干,密封-20℃短期保存 ； 3.染色前冷丙酮4℃固定10-20分，PBS冲洗2次×5min； 4.必要时细胞膜打孔。 5.通常苏木精复染细胞核，水溶性封片剂封片。 (三)培养细胞免疫细胞化学染色 1.固定 贴壁细胞制备细胞爬片；悬浮细胞制备滴片或者甩片 4%多聚甲醛或冷丙酮室温固定10-20min 2.晾干 易脱片的细胞大于2h， PBS冲洗2次×5min； 3.细胞膜打孔 二、免疫组织化学染色其它方法比较 （一）DAKO公司EnVision TM Systems 将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。 （二）迈新公司的Max vision试剂盒 根据聚合物技术把过氧化物酶与抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚物上形成多聚物分子。该试剂盒仅一瓶装，具有以下特点：多聚物技术，使得酶分子与二抗IgG分子直接结合形成的多聚物分子高度的敏感性、染色强度可与SP法媲美；可以避免由于生物素引起的非特异性背景显色，更适合于生物素含量较高的组织细胞的免疫组化实验；孵育时间短，只需孵育15分钟。试剂盒不含显色系统，需要另购DAB 迈新公司EliVisionTM?plus 试剂盒 将多个抗鼠和抗兔的IgG分子标记在辣根过氧化物酶聚合物上，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号，其放大效应比SPTM、MaxVisonTM试剂盒更高，背景更清晰，鼠、兔抗体均适用，核定位更强。特别适合于生物素含量较高的组织细胞的免疫组化研究； EliVisionTM? Super 检测试剂盒 ElivisionTM plus 的基础上，改进了增强剂，使更多辣根过氧化酶聚合物与一抗结合，以增强放大效果。与ElivisionTM plus 试剂盒比较，它对鼠一抗的放大效果与ElivisionTM plus 相似，但对兔一抗的放大效果，要比ElivisionTM plus 提高2-3倍。其次，增强剂与酶标志聚合物在组织切片上的培育时间均只需10分钟，较ElivisionTM plus 所需的20分钟与30分钟，大大节约了时间。 （三）北京康为Polymer-二步法IHC试剂盒(带DAB显色液) 将多个抗鼠和抗兔的IgG分子与多个辣根过氧化物酶标记到同一大分子骨架上形成聚合物。 （四）美国GBI的Polink-2 plus兔超敏二步法免疫组化试剂盒 将二抗的单价Fab片段和酶聚合在一起，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号，既保留抗体特异性结合抗原的能力，又可有效地避免聚合分子过大而造成的空间位阻。 用于检测一抗是兔来源的抗体。具有简单、快速、敏感等特点，因为系统中不再使用生物素，所以避免由于内源性生物素所造成的背景染色。独特的Polymer Helper可以使细胞的通透性发生改变，有利于大分子的检测系统更好地结合所检测的一抗分子，此检测系统是目前已知的灵敏度最高的系列免疫组化检测系统。 （五）巴傲得Super Sensitive?TM IHC试剂盒（鼠/兔通用） 聚合技术将更多HRP偶联在一个IgG分子上，克服了生物素标记引起的背景问题和葡聚糖偶联HRP造成的空间位阻问题，使信号放大效果更强，并减少了非特异性背景。 用全新特制的HRP保护剂，使HRP活性和敏感性长期保持稳定；同时高活性的IgG和放大剂使得反应时间大大缩短，每步只需10分钟。 产品特点： 1）特异性强，背景极低 2）反应时间短，每步只需10分钟 3）鼠、兔通用，无交叉反应???? ? 三、免疫组织化学染色结果评价 排除非特异性染色、假阴性、假阳性结果 阳性对照实验 阴性对照实验 非特异性染色 细胞和间质染色无区别，或间质更强 染色无特定部位、无结构性 染色分布无规律，某一部位均匀染色 染色出现在干燥部位、边缘、刀痕、组织折叠处。 （一）以抗原表达模式定位 1．细胞质内弥漫性分布，即胞质型阳性反应； 2．细胞核周边胞质内分布，其判别要点是细胞核轮廓被勾画得很清楚。 3．胞浆内局限点状阳性反应。 4．细胞膜线性阳性反应，大多数淋巴细胞标志物的染色均如此。 5.细胞核阳性反应如BrdU及雌、孕激素受体蛋