黄河裸裂尻生长激素基因的PCR扩增和克隆.docVIP

黄河裸裂尻生长激素基因的PCR扩增和克隆 摘要：黄河裸裂尻（Schizopygopsis pylzovi ）栖息于高原地区的黄河上游干支流及柴达木水系,是我省特有的地方性土著鱼种。但近几年由于其生存环境受到污染和过度捕捞等原因,渔业资源破坏严重,所以人工养殖成为今后发展的主要方向。为解决黄河裸裂尻鱼的人工养殖生长周期长这个瓶颈,拟采用分子生物学的方法，从黄河裸裂尻鱼的脑垂体中分离得到纯度较高的总RNA并得到生长激素cDNA片段,进一步获得黄河裸裂尻生长激素基因序列。这也是对我省开展的高原特有鱼种的人工驯化和养殖计划的有力技术保障。在黄河裸裂尻鱼的饲料中添加适量的黄河裸裂尻鱼生长激素可望提高其养殖生产率。目前我省在渔业生产中未见该领域的研究报道，特别是对青藏高原特有的裂鳆鱼亚科的鱼种通过生物工程的方法提高其生产性能的更是空白。另外，在系统进化中裂鳆鱼亚科的鱼种亲缘关系较近，也有可能对青藏高原其它裂鳆鱼亚科的鱼种比如青海湖裸鲤、花斑裸鲤等有重要的借鉴效果。 本实验采用异硫氰酸胍-苯酚抽提法（三试剂一步法）从黄河裸裂尻鱼的脑组织提取总RNA，应用反转录（RT-PCR）方法克隆生长激素cDNA,进一步克隆得到黄河裸裂尻生长激素基因，通过转染将其生长激素基因导入大肠杆菌中进行表达得到高效表达蛋白。 通过NCBI搜索数据库检索，将黄河裸裂尻生长激素（GH）基因的序列、氨基酸序列同其他鱼类基因组全序列和氨基酸序列做BLAST，发现黄河裸裂尻鱼核苷酸序列、氨基酸序列与青海湖裸鲤、鲤鱼、斑马鱼等同属鱼类相应的核苷酸序列和氨基酸序列之间的同源性较高；氨基酸序列相似性分别为100%、98%、94%。利用clustalx1.83、DNAstar、DANMAN、BioEdit、MEGA4.0等生物软件制作黄河裸裂尻与其它鱼种的系统进化树，树中发现同属鱼之间的鱼亲缘关系较近，但各个亚科的鱼并不是很规律的聚在一起，而是表现出一定的差异。 根据黄河裸裂尻鱼生长激素基因核苷酸序列比对发现，黄河裸裂尻与其他同属鱼类的同源性较高，通过其氨基酸序列的比对发现黄河裸裂尻与青海湖裸鲤的亲缘关系较近，其氨基酸序列相似性为100%，但是，尽管黄河裸裂尻与青海湖裸鲤所编码的氨基酸相似性为100%，但其编码氨基酸的基因序列中也有1个核苷酸位点不同，可能是不同种群间歧异性的具体表现。 人工合成的GH蛋白在化学结构和生理作用方面与天然GH蛋白完全相同，但费用较为昂贵，利用分子生物学的方法在原核细胞中克隆并获得高效表达蛋白，在理论和实践上是可行的。本实验用 BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 进对黄河裸裂尻鱼GH基因与质粒pQE30进行双酶切，用T4DNA连接酶连接后,获得重组质粒，并在大肠杆菌RB791中表达获得14.4kDa的融合蛋白。本实验为今后的GH蛋白的分离纯化及对该蛋白生物活性分析提供了可靠的技术支撑。 关键词：黄河裸裂尻 生长激素基因 克隆 基因表达1．黄河裸裂尻简介 中文名称： 黄河裸裂尻鱼 外文名称： Schizopygopsis pylzovi Kessler (Kess-ler) 别称： 小嘴湟鱼、小嘴巴鱼、[鱼景]鱼 目： 鲤形目CYPRINIFORMES 科： 鲤科Cyprinidae 属： 裸裂尻鱼属Schizopygopsis Oncorhynchus keta ) ,虹鳟(Salmo gairdneri)、银鲑(Oncorhynchuskisutch )、金枪鱼(Thunnus thynnus )、王鱿( Oncorhynchus tshawytscha )、罗非鱼(Oreochromis niloticus )、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)白鲢(Hypophthalmichthys mulitrix，silver carp)、金鱼(Carassius auratus )、团头鲂( Megalobrama amblycephala )等的生长激素基因先后被克隆.到目前为止，克隆的鱼类生长激素基因和cDNA达40余种. 黄河裸裂尻（Schizopygopsis pylzovi ）栖息于高原地区的黄河上游干支流及柴达木水系。它也是我省特有的地方性土著鱼种。但近几年由于其生存环境受到污染和过度捕捞等原因,渔业资源破坏严重,所以人工养殖成为今后发展的主要方向。为解决黄河裸裂尻鱼的人工养殖生长周期长这个瓶颈,拟采用分子生物学的方法，从黄河裸裂尻鱼的脑垂体中分离得到纯度较高的总RNA并得到生长激素cDNA片段,进一步获得黄河裸裂尻生长激素基因序列。这也是对我省开展的高原特有鱼种的人工驯化和养殖计划的有力技术保障。在黄河裸裂尻鱼的饲料中添加适量的黄河裸裂尻鱼生长激素可望提高其养殖生产率, 分离的黄河裸裂尻鱼的生