课内生物技术大实验部分操作程序-易.docVIP

生物技术大实验操作指南 实验一 鸡输卵管总RNA提取（溶菌酶基因的提取） 原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加Trizol快速匀浆碾磨，加一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，无RNase的ddH2O溶解。 试剂与设备： TotalRNAExtractor（Trizol）或RNAsimple Total RNA Kit，氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddH2O Free RNase。研钵，玻璃匀浆器，16000转低温冷冻离心机。 步骤： 新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1ml Trizol冰浴中匀浆，RT 5-10 Min。 加200ul 氯仿，振荡15 Sec，RT 3 Min。 4℃ 12000rpm，离心10Min，吸取上层水相，转入新的离心管。 加500ul 异戊醇柔和混匀，RT沉淀30Min,离心同上，留取沉淀。 加1ml 75%乙醇洗涤沉淀 2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，RT晾干3-5Min。 50ul ddH2O Free RNase 溶解沉淀。 检测RNA纯度与浓度。 实验二 溶菌酶基因第一链cDNA合成 原理： mRNA经M-MuLV催化，以Oligo dT为引物，将mRNA反转录合成cDNA，此cDNA为单链。 试剂与设备：M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离心机。 步骤： 1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物： 总RNA 或 Poly(A)+ RNA或特异性RNA Xμg Oligo dT (0.5μg/μL) (20 pmol) 1μL RNase free ddH2O 定容至12μL 2. 轻轻混匀后离心3~5 s，反应混合物在65℃温浴5 min后，冰浴30 s，然后 离心3~5 s。 3．将试管冰浴，再加入如下组分： 5×Reaction Buffer 4μL RNase Inhibitor ( 20 U/μL) 1μL dNTP Mix(10 mmol/L) 2μL M-MuLV RT（200 U/μL） 1μL 注：若5×Reaction Buffer出现白色结晶，需37℃温浴数分钟至白色结晶完全溶解，震荡混匀。 4．轻轻混匀后离心3~5 s。 5．在 PCR 仪上按下列条件进行反转录反应cDNA 合成 42℃ 30-60 min 6.终止反应 95℃ 5 min(酶失活)，处理后，置于冰上放置或-20℃保存。 * M-MuLV RT酶最后加。 实验三 鸡溶菌酶基因的PCR扩增 原理：利用耐热Taq酶（一种DNA聚合酶），以四种dNTP为底物，在引物的诱导下，经过变性、退火、延伸三步反应，体外合成DNA双链分子。 试剂与设备：2X PCR Plus MasterMix，ddH2O，模板，上、下游引物，掌上离心机，PCR仪。 步骤： 反应体系如下： 模板DNA （第一链cDNA） X ul（＜1ug） 引物1（10 uM） 1 ul 引物2（10 uM） 1 ul 2X PCR Plus MasterMix 12.5ul ddH2O 10.5-X ul Total 25 ul 如果体系变化，可按此比例添减。 PCR反应条件： 95℃ 5 Min 95℃ 30Sec 56℃ 30Sec 30 Cycles 72℃ 30Sec 72℃ 10Min 结果检验 取3-8ul，PCR产物，1%Agarose 电泳。（切下目的条带-20保存） 实验四 PCR产物的回收纯化 原理：PCR产物经过琼脂糖电泳分离，切取含目的产物的胶条，用胶回收试剂盒回收。 试剂与设备：DNA胶回收试剂盒，TBE电泳Buffer，琼脂糖，Goldview染料，2000 DNA Ladder，无水乙醇，TE或ddH2O，恒温水浴锅，水平电泳仪，高速冷冻离心机等。 步骤： 通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5 ml离心管中，称重。 根据胶块的重量和浓度，按每100 mg琼脂糖（如胶块不足100 mg则用水补充至100 mg）加300- 600 μl的比例加入Binding Buffer II。 将离心管置于55℃水浴5-10 min，间或混匀，直至胶块完全溶化。 当目的片段 500 bp时，加入所使用的Binding Buffer II 1/3体积的异丙醇，混匀。当目的片段 ≥ 500 bp时，此步骤可以省略