课内生物化学实验复习总结资料(全).docVIP

生化实验五大技术 分光光度技术 1.定义：根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。 2.基本原理： 透光度T=It / Io 吸光度A=lg(Io/ It) 朗伯-比尔(1ambert-Beer)定律 :A＝KLc 【K为吸光率，L为溶液厚度（cm），c为溶液浓度 （mol/L）】 摩尔吸光系数ε：1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时，在某一特定波长下 的吸光度。 c=A/ε 3.定量分析： （1）标准曲线(工作曲线)法 （2）对比法 （3）计算法： c=A/ε （4）差示分析法（适用于浓度过浓或过稀） （5）多组分混合物测定 4.技术分类 分子吸收法原子吸收法； 可见光（400~760 nm）紫外光（200～400 nm）红外光（大于760 nm）分光光度法； 应用方向 有机物成分分析结构分析——红外分光光度法 测定人体内的微量元素——原子吸收分光光度法 电泳技术 1.定义：带电荷的供试品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。? 2.基本原理：球形质点的迁移率与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。 ν=Q/6πrη 3.影响电泳迁移率的因素： 电场强度：电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的pH值：溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大 溶液的离子强度?：电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 技术分类： 自由电泳（无支持体） 区带电泳（有支持体）：滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等 电泳分析常用方法及其特点： 小分子物质——滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳 复杂大分子物质——凝胶电泳 （1）醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，消除纸电泳中出现的“拖尾”现象 ②分离速度快，电泳时间短 ③样品用量少 ④经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化，有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存 →特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测（胰岛素、溶菌酶、胎儿甲种球蛋白） 琼脂糖凝胶电泳 ①琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用 ②琼脂糖凝胶弹性差，不适合管状电泳 →用于等电聚焦、免疫电泳、血清脂蛋白等蛋白质电泳，以及DNA、RNA、核苷酸的分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①可调节孔径大小 ②机械强度好，有弹性 ③分辨率高，用途广 ④无电渗 →用于不同分子量蛋白质的电泳分离 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 该种电泳使蛋白分子相对迁移率(Rf)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量 →最常用定性分析蛋白质的电泳方法，特别用于蛋白质纯度检测分子量测定 等电聚焦电泳技术 利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质 →由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，适合研究蛋白质的微观不均一性 毛细管电泳 ①高灵敏度 ②高分辨率 ③高效快速 ④样品少 ⑤成本低 →符合对多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等生物大分子的分离条件 层析技术 固定相：固体物质或者是固定于固体物质上的成分； 流动相：可以流动的物质，如水和各种溶媒 1.原理：当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。 2.技术分类： ①按层析原理分类 ②按操作形式不同分类： 3.层析法的特点与应用 ①根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量； ②析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图； ③层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间； ④分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快 →适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样