微生物菌种纯度检测技术规程.docVIP

微生物菌种纯度检测技术规程1　范围 本规程规定了古菌、细菌、真菌、病毒（种）纯度检测的程序和方法。 本规程适用于从事微生物菌种资源保藏及研究的机构、大学、企业、个人等。2　术语、定义 下列术语和定义适用于本规程2.1 纯度检测?purity?check 指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。2.2 纯培养??pure?culture 由单个细胞的后代组成的培养物，即单细胞培养物或无性繁殖系。通常是由挑取单个菌落或利用单胞分离技术，移种繁殖获得。3　菌种的纯度检测3.1　古菌和细菌的纯度检测3.1.1　菌落形态 在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。3.1.2　细胞形态 对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜等特征应相似3.1.3　芽孢大小、位置、形状 宜检测样品是否形成芽孢，对形成芽孢的菌种，其芽孢大小、位置、形状应相似。3.2　放线菌菌种纯度检测3.2.1　菌落形态 在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线,挑取单菌落，适宜培养后，在同一平板上单菌落形状、大小、表面状况、质地、光泽、颜色等应相似。如怀疑为细菌污染，则30液体培养24小时，培养液不应浑浊，如浑浊则视为细菌污染。3.2.2　培养特征 分别接种三种以上培养基，在三种以上培养基上的培养特征应想同，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的颜色等。3.2.3　孢子丝及孢囊 在特定的培养基、培养温度及培养时间等条件下，孢子着生方式、孢子丝形态及其颜色或孢囊着生位置（气丝或基丝）、孢囊的形状，大小应呈现出一致性。3.3　酵母菌种纯度检测3.3.1　菌落形态 应对菌落形态相似性进行检测。在特定的培养基上，通过对待检测菌株进行稀释或划线涂布平板获取单菌落，一定的培养条件下，比较同一平板内，菌落的大小、形状、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽等应一致。3.3.2　个体形态 应对检测样品的个体形态进行检测。在指定的培养基及培养条件下，细胞形状、大小及细胞的增殖方式应一致。3.3.3　繁殖方式 酵母繁殖的方式应一致，如是芽殖，出芽的方位、数量应一致。3.4　丝状真菌菌种纯度检测3.4.1　菌落特征 菌落的形态等表观特征应一致。3.4.2　菌丝特征 在特定的培养基和培养条件下，菌丝分隔、菌丝形态等应一致。3.4.3　其他主要显微特征应一致3.4.4　检测是否有细菌污染3.4.5　对于外观上不能确定菌种纯度的，利用单胞分离技术获得纯培养物进行对比，其菌丝、孢子等特征应与原始菌株的描述一致。3.5　病毒的纯度检测3.5.1　纯粹检查 应将待检病毒液直接接种含硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪蛋白胨琼脂培养基（G.A）、葡萄糖蛋白胨汤。通过一定温度时间培养后，检查结果应无细菌生长为纯粹。3.5.2　支原体检查 检测由禽胚组织或其细胞所培养的病毒应用改良Frey氏培养基。检测其它培养方法所得病毒应用支原体培养基。任何一次琼脂平板上出现支原体菌落，判为阳性。阳性对照中至少有一个平板长菌落，而阴性对照中无菌落生长，则检验有效。3.5.3　外源病毒检查 病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞基质培养，因此，有可能造成外源因子（特别是外源病毒因子）的污染。为了保证制品质量，需要对毒种和细胞进行外源因子检测。3.5.3.1 病毒种子批外源因子检查 对病毒主种子批或工作种子批，应抽取足够检测试验需要量的供试品进行病毒外源因子检测。在试验前应用特异性抗体（血清）中和本病毒（或单克隆抗体），所用的抗体免疫源应采用与生产疫苗（或制品）不同种而且无外源因子污染的细胞（或动物）制品。如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚，应来自SPF鸡群。以下方法可以选择一种或多种进行。3.5.3.1.1?动物试验法3.5.3.1.1.1?小鼠试验法 取15－20g小鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，每只脑内接种0.03ml，同时腹腔接种0.5ml。至少观察21天。在观察期内至少有80％最初接种的小鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所用在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接观察期病理改变，并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和颅腔接种另外至少5只15－20g小鼠，并观察21天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。3.5.3.1.1.2?乳鼠试验法 取出生后24小时内的乳鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，脑内接种0.01ml，同时腹腔接种至少0.1ml。每天观察，至少14天