课内生物工程综合实验60354.docVIP

实验三、重组菌细胞破碎及酶活检测 1、实验目的 掌握超声波细胞破碎方法及木聚糖酶活性测定方法 2、实验原理 超声波是指频率超过人耳可听范围(16~21kHz)的波，即频率为20kHz以上的波。微生物细胞在超声波的作用下，细胞结构受到破坏，而使细胞破碎。超声波进行细胞破碎的效果与微生物的种类、浓度、超声波频率、输出功率和破碎时间有密切关系。使用超声波必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。 木聚糖酶的活性通常是测定其水解底物木聚糖后生成的产物的还原末端——木糖的增加量来进行的，而木糖的含量可以利用其与某些显色试剂（如DNS试剂，PAHBAH）反应后生成在特定波长下有特异吸收峰的有色化合物，从而通过分光光度法测出。 3、实验材料和设备 A. 试剂 ①测定酶活用试剂：在实验一已配制 ②0.5 %燕麦木聚糖： 0.5木聚糖溶于100 mL无菌水中，在磁力搅拌器上搅拌使之呈均一的悬浮液，加终浓度0.02%的叠氮化钠防止微生物生长。 ③ 8X Binding buffer： 40 mmol/L 咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.9 B．实验设备 分光光度计、水浴锅、pH计、冰、烧杯、煮沸电炉、煮沸用的浮漂、移液管、磁力搅拌器、超声破碎仪X Binding buffer悬浮的10h发酵结束后的细胞（由100 ml发酵液离心来的细胞用4 ml 1X Binding buffer重悬），室温溶化后，用超声波破碎仪破碎细胞。1mL样品的超声条件为：50 Hz超声15s,间隔10 秒，如此多次即可。用1X Binding buffer悬浮的细胞次数应该适当延长，当溶液变清即可停止。 ② 破碎后的样品在12000g，4℃离心20min，弃沉淀。1mL的样品用来检测酶活性，用1X Binding buffer悬浮的细胞样品次日用于酶的纯化，此时放置于-70℃保存。 ③ 0h、1h、4h、6h、8h、9h、10h时的样品中木聚糖酶活性的测定： 记录好各个取样点时测得的数据，将其代入实验一所得标准曲线方程中后算出每ml发酵液的酶活性。 注意：每个时刻的样品需做三次平行，所有平行样品应该一批次同时做完，以减小不同批次实验引起的误差；酶液可能要适当经过稀释，以使最后读出的A405值在0.1～1之间，正式实验前应该做预实验摸索好稀释倍数。 实验四、重组木聚糖酶的纯化 实验目的 掌握His-tag亲和层析柱纯化蛋白的方法 实验原理 由xynB基因编码的木聚糖酶有很高的热稳定性，在90℃下保温2h，仍然有90%的活性，基于这一点，我们可以先用加热的方法除去酶液中的大部分不耐热的杂蛋白。 蛋白质表面的某些氨基酸残基如：组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团（后两种与金属离子的作用要小得多），可与金属离子亲和结合。用螯合剂可以将金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+His-tag）：组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段Ni-NTA亲和层析介质8X Binding buffer： 40 mmol/L 咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.9 4X Elute buffer： 4 mol/L咪唑，2 mol/L NaCl, 80 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.9 8X Charge buffer： 400 mmol/L NiSO4 8X Wash buffer：4 80 mmol/L咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.9 4X Strip buffer： 400 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl, 80 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最终pH调到7.9 B.实验设备 移液管、试管、分光光度计、pH计、控温水浴锅、煮沸电炉、煮沸用的浮漂、铁架台 4、实验步骤 ① 热处理： 将样品装入洗干净的玻璃试管中，在70℃水浴锅中保温30min，然后18000g离心4℃离心30min除去杂蛋白。 ①his-tag亲和柱处理 取1mL Ni-NTA亲和层析介质1X Charge buffer洗柱子，再用3柱体积的1X Binding buffer洗柱子。 ②上样 样品上样前，取出少量样品作为后面的SDS实验用。把样品加入柱子，用10柱体