中学教育荧光定量PCR技术讲座：理论基础、引物及探针设计、体系优化、实验方案、数据分析、污染防控.pptVIP

二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： 在Taqman探针法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，还要5’-3’外切酶 的活性来切断探针链产生荧光，普通PCR的延伸温度为72℃，此温度为Taq 酶聚合作用的最佳温度；Taqman探针法反应中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活 性的同时，还需要Taq酶5’-3’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，Taq酶 5’-3’外切酶活性的最佳温度为60℃，所以Taqman PCR反应的一般采用两步 法，即95℃变性，60℃复性延伸。 在Taqman探针及引物的设计过程中，引物的TM值已经确定为60℃左 右，在每轮PCR循环的复性过程中（95→60℃），为了确保探针先于引物与 模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10℃左右，所以Taqman探针及引 物一般都是引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右。 二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： （1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子； （3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右； （4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使 是被