生物大分子分离技术综述.docVIP

生物大分子分离技术利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等加入欲透析的样品溶液，悬挂在容器中经常更换水加大膜内外溶液浓度，必要时适当加热，并加以搅拌，以利透析快。透析是否完全，须透析膜内溶液进行。溶剂超滤膜筛介，膜两侧的压力差为动力，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效局限性不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50%的浓度。gel electrophoresis, 2-DE)技术又称二维凝胶电泳技术，是目前常用的唯一一种能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，第一，采用等电聚集电泳。第二，采用了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。广泛应用于生物学研究的各个领域，其原理是将高分辨率的等电聚集电泳和SDS电泳联合组成双向电泳。 3.1.4电泳与其他联用技术 毛细管电泳时带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中接其淌度或分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。其分离模式有：毛细管区带电泳、胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等点聚焦，毛细管电色谱。毛细管电棘(EE)作为一种分离技术与质谱(MS)联用作为一种检测方法，在食品分析领域具有重要优势，因为它结合了毛细管电泳的强分离能力以及质谱在定性和确证方面的强大功能。近来，许多有关多维毛细管电泳分离技术的设想已被提出有些还得到了初步的尝试，其分离的优势也得到人们的关注。与传统的分离方法相比，CE具有分离效率高、分析速度快、样品及试剂用量少等特点，使其成为极为有效的分离技术，广泛应用于分离蛋白质、糖类、核酸等物质[5]。 毛细管电色谱是将常规色谱填料填充到毛细管中 , 或在毛细管内表面键合、涂敷固定相 , 以电渗流作为流动相的推动力 , 根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异和在电场中迁移速率的不同而实现分离的一种高效微分离技术。近年来 CEC 在分离分析生物大分子中应用较为广泛。不少研究工作者开始将研究方向转移到CEC分离分析生物大分子。如 CEC 结合了 CE 的高效性和 HPLC 的高选择性 , 是一种新型的微柱分离分析技术 [7], 已成为蛋白质等生物大分子分离分析的方法 , 它的出现为蛋白质的分离分析提供了一条新的有效途径[8]。但目前 CEC 主要是以电驱动流动相为分离模式, 操作中易产生气泡 , 使其受到很大的限制。加压毛细管电色谱 (PEC) 的出现解决了长期限制 CEC 广泛使用的问题 ,PEC克服了仅靠电渗流驱动的一些限制因素 , 可方便地对流动相组成、性质、流速进行调节 , 抑制气泡的形成 , 尤其能实现梯度洗脱 , 是 CEC 发展的重要方向[9]。 3.2色谱技术 色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品 中的组分通过固定相时 ，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。色谱被认为是迄今人类掌握的对复杂混合物分离能力最强的手段。特别是液相色谱，大都在室温条件下进行；所有的流动相可以是与生理液相似的具有一定pH 值的含盐的缓冲水溶液 ，有时也使用某些能与水互溶 的有机溶剂；所用填料的表面经过了各种相应的化学修饰和覆盖，这样就为生物大分子的分离提供了温和的条件和软接触表面，有利于它们保持原有的构象和生理活性。所以液相层析作为生物大分子的分离重要方法具有很大的发展前景 。据分离机制不同，液相色谱可分四大基础类型 ：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶色谱，可根据生物大分子结构 、生物活性、分子量大小等性质不同，选择不同的分离纯化模式。 多维液相色谱法是利用两根或多根性质不同的色谱柱，通过一定的接口和切换技术对不同色谱分离模式的结合，或一根色谱柱内通过填充不同分离模式的色谱填料，完成对复杂样品的待分析组分进行分离。多位液相色谱具有分离样品动态范围宽、分辨率高、分析速度快、自动化程度高等优点。近几年来，多维液相色谱分离模式在蛋白质组学和生物制药领域得到了很广泛的应用。 亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的